Piezoelektriska kirurgi har lett till förbättringar i människors käkkirurgi och dental kirurgi. Vi har utvecklat ett protokoll för att optimera piezoelektriska kirurgi för kraniala fönster kirurgi hos möss.
Multiphoton mikroskopi har anpassats allmänt för imaging nervceller i vivo. Upprepade imaging kräver implantation av ett kranium fönster eller upprepad förtunning av skallen. Kraniella fönster kirurgi utförs normalt med en hög hastighet roterande borr, och många utredare finner det utmanande att förhindra att borren skada känsliga dura och blodkärl. Omfattande utbildning och praktik som krävs för att ta bort benet utan att skada underliggande vävnad och därmed kraniala fönster kirurgi kan vara svårt, tidskrävande och producera vävnadsskada. Piezoelektriska kirurgi, som används flitigt för käkkirurgi och dental kirurgi, använder tredjeparts ultraljud vibrationer för att ta bort ben utan att skada mjuka vävnader. Vi har utvecklat en metod som anknyter piezoelektriska kirurgi för att förbättra kraniala fönster kirurgi hos möss som förberedelse för multiphoton imaging. Jämförelser inom vårt lab tycker att metoden kräver mindre kirurgi tid och har en lägre genomsnittlig frekvens av komplikationer på grund av dural blödning än kraniala fönster kirurgi med en roterande borr.
Kraniella fönster kirurgi inför multiphoton imaging i vivo gnagare har blivit en viktig teknik i neurovetenskap. Avlägsnas eller gallring av ben är nödvändigt att förbereda musen för optisk imaging med multiphoton Mikroskop. Denna operation utförs antingen genom att helt ta bort ett område av ben att exponera underliggande dura1, eller genom gallring en region av ben utan fullständig borttagning från dura2. Metoden med tunn skalle kan producera mindre inflammation och aktivering av mikroglia3 men ger en grundare djup Imaging, en mindre avbildning fönsterstorlek (200 µm) och en begränsad tidsperiod under vilken fönstret kan avbildas på grund av ben återväxt2 . Tillägg av ett polerat och förstärkt glasfönster (portar) kan öka imaging storlek och imaging period men är svårt att utföra4.
Både aktuella operationer använda en hög hastighet roterande borr tunna eller ta bort benet från skallen. Tunn skalle tekniken använder också en skalpell efter borren att ytterligare tunna ben2. Hamnar tekniken kräver det extra steget för hög hastighet polering med grus4. I en hög hastighet orsakar roterande borr, en luftdrivna turbin eller elmotor borrkronan att snurra med hög hastighet. Som roterande borrar avsnitt både ben och mjuk vävnad, finns det en risk för skada dura och underliggande blodkärl. Framgången av operation beror på skickligheten hos kirurgen. Förutom dessa windows förberett med mekaniska kirurgiska metoder, varit en kemisk metod av optiskt rensa skallen med olika lösningar utvecklade5,6. Eftersom piezoelektriska kirurgi är en mekanisk metod för kirurgi, kommer våra jämförelser här dock begränsas andra mekaniska metoder.
Piezoelektriska kirurgiska enheter använda ultraljud vibrationer att bryta ner mineraliserat ben utan att skada underliggande mjukdelar, och därmed erbjuda en metod för att snabbt tunna ett stort område av ben. I en piezoelektrisk kirurgiskt handstycke, turbinen ska ersättas med en stack av keramiska skivor och när nuvarande appliceras, diskarna vibrera vid ultraljud frekvenser. Vibrationerna överförs genom handstycket till diamant belagda tips att skära igenom ben utan skada mjuka vävnader, en fördel över roterande borrar som inte diskriminerar mellan vävnadstyper. Piezoelektriska kirurgi utvecklades ursprungligen för användning i mänskliga av Tomaso Vercellotti och har lett till förbättringar i tandvården och cranio-maxilofacial kirurgi7,8,9,10,11 .
Piezoelektriska kirurgi har använts för att skapa en osteotomi Wistar råttor och hittades av magnetisk resonanstomografi (MRT) och histologi att producera betydligt mindre skada än en traditionell tandvård borr12. Författarna drog slutsatsen att piezoelektriska kirurgi var säker för att ta bort benet nära mjuk hjärnvävnad. Möss, men har en tunnare dura som lättare skadas, och att studien förbereda inte windows för kronisk optisk imaging. Kronisk imaging kräver att blodkärlen inte är skadade och att blodproppar inte utgör under fönstret. Skador på dura leder till inflammation som orsakar fönstret till molnet, och aktiverar mikroglia och spridningen av reaktiva astrocyter. Här har vi optimerat piezoelektriska kirurgi för möss att skapa både tunna skalle och full ben borttagning kraniala windows lämplig för kronisk imaging. Vi jämförde denna operationsteknik till kraniala fönster operationer beredd med en hög hastighet roterande borr.
Operationen kan ändras genom att ändra den kirurgiska spetsen. Det finns många olika storlekar av spets som kan tillämpas på handstycket. Ändra storlek eller form av spetsen kommer att resultera i olika stora fönster. Förutom 4 mm spets, vi också försökt en 3 mm spets och fann det också fungerat väl. Även med bevattning med is kallt ACSF, vi var inte kunna få bra resultat med tips som var för trång (cirka 0,25 mm) på grund av koncentrerad vibrationer orsakar alltför mycket värme och brännande ben leder till skada för att underliggande dura. Vi har inte försökt mängden andra tips som är tillgängliga och vi räknar med att andra labb kan hitta nya tillämpningar för dessa olika tips. Operationen är relativt enkelt, hittade vi att det finns flera steg som kräver felsökning. Först är att den vibrerande spetsen producerar en hel del turbulens i den ACSF, vilket minskar synligheten och producerar svårigheter i att fastställa ben djup under ben gallring steg i operationen. Vi rekommenderar att om det är svårt att se hur tunn benet är, ta en paus för att torka skallen och fönster genom att tillämpa en steril bomullspinne till sidan av benet. Gäller inte bomullstuss direkt till fönstret, eftersom den grova ytan är skadligt för tunna ben. Efter kontroll djupet, återapplicera ACSF och fortsätta med operationen. Vi fann också att om det finns skador på dura, det är oftast på grund av kirurgen att sätta för mycket press på spetsen. Holding handstycket mer skonsamt och tillämpa mindre kraft kommer sannolikt att åtgärda problemet. Om kirurgen är med våld skrapning spetsen på benet, kommer det orsaka ett avbrott i den tunna ben och skada skallen. Slutligen om underliggande dura visas efter gallring ben, blåmärken, troligtvis på grund av överskottsvärme från vibrationer. Ökande ACSF flödet kommer att fixa problemet.
Den största begränsningen av PHASOR är att handstycket kan tunna ben, men kan inte ta bort alla ben över dura. Diamant belagda spetsen har små grov knölar. Gnuggbilden behövs att tunna skallen skulle slipa dura och orsaka blödning om det användes för att ta bort alla ben. Att ta bort återstående tunna lager krävs således användningen av tången. Medan det finns pågående debatt om huruvida imaging genom en tunn skalle producerar mindre inflammation och mindre spridning av mikroglia och reaktiva astrocyter, i vissa fall är ett fönster med inga ben kvar att föredra, t.ex., att ge ett större djup imaging3 .
Vi har optimerat kraniala fönster förberedelse för multiphoton imaging i möss. PHASOR är, att vår kunskap, den första tillämpningen av piezoelektrisk teknik till gnagare kraniala fönster kirurgi för optisk imaging. Finner vi att användningen av piezoelektriska kirurgi hos möss delar fördelarna med ökad hastighet och minskade biverkningar rapporterade också människor7,8,9,10. Utnyttjande av piezoelektriska enheten resulterade i snabbare operationer (figur 2A) och färre biverkningar för blödning jämfört med en höghastighets rotary borra (figur 2B). Vi hittade också, inom våra lab, att PHASOR var lättare för nya kirurger att lära än traditionella metoder för kraniala fönster kirurgi. Fördelarna med hastighet och användarvänlighet är sannolikt att skilja sig bland kirurger. Tunn skalle preparat kräver normalt 30-45 min till tunna benet med en borr och skalpell2, medan den PHASOR metoden kräver vanligen mindre än 10 min.
Vi hittade att i windows förberett med PHASOR kunde vi bilden kalcium transienter i lager 4 pyramidal nervceller i motor cortex som hade transfekterats med adeno associerade virus kodning indikatorn kalcium JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Vi fann också att, jämfört med en tunn skalle kraniala fönster beredd med en roterande borr och skalpell, imaging regionen var större, medan en tunn skalle beredd med en roterande borr och skalpell har en tänkbar fönster av 20 µm diameter2 . Med PHASOR kunde vi snabbt tunna en yta på 3-4 mm. Detta liknar fönstret imaging rapporterade med portar4. Denna större fönster behåller fördelen snabba imaging rapporterade för tunn skalle windows förberett med en dental borr och skalpell. Dessutom fönstret förberett med PHASOR kan avbildas omedelbart, i motsats till traditionella bone borttagning windows som kan kräva veckor att läka innan fönstret kan vara optimalt avbildas3.
Denna teknik kan användas för att studera förändringar i blodflöde i kärlen under dura. En viktig framtida studie är att jämföra immunoreaktivitet av PHASOR med andra metoder av kraniala fönster. Det skulle vara viktigt att avgöra om PHASOR producerar mindre inflammation jämfört med befintliga metoder. Vi hoppas att den piezoelektriska operationsteknik som dokumenteras här gör mer labs att utföra kraniala windows och framgångsrikt använda multiphoton imaging i vivo.
Kontrollera att handenheten är inställd att vibrera på den lägsta inställningen och att ACSF är att vara bevattnade med en konstant hastighet. Den iskall ACSF måste tillämpas ständigt eller det kommer att värma upp och skada dura. Vi hittade att ACSF måste tillämpas med en hastighet av minst 1 mL/min. antingen använda en spruta hålls i handen, eller använda en Peristaltisk pump, i stället för inbyggd bevattning i handstycket. Bevattningssystemet i handstycket matar ut ACSF alltför kraftfullt och producerar för mycket turbulens, vilket avsevärt kommer att försämra sikten.
The authors have nothing to disclose.
Tamara Zeric för att hjälpa till att uppnå multiphoton bild i denna uppsats. Stöds av hjärnan & beteende, Parkinson och JPB stiftelser, R01 MH108186 och R01 DA07418. F31 gemenskap 1F31MH109293-01A1 S c.
Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
Stereotax frame | Kopf | 963 | |
Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
Mice | JAX | 664 | |
Prairie Ultima multiphoton microscope | Olympus | ||
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |