نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد
Summary
هذا البروتوكول يقدم نهجاً لتحليل الترنسكربيتوم كله من الأجنة الزرد، اليرقات، أو فرز الخلايا. نحن تشمل عزلة من الجيش الملكي النيبالي، وتحليل المسار للبيانات رناسيق، والمستندة إلى بكر qRT التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني.
Abstract
تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد مسارات الرواية الأساسية تعمل الملاحظة. الزرد نموذج ممتاز للتقييم السريع لأسرة الترنسكربيتوم من السكان الخلية الحيوانية أسرة أو فرد بسبب السهولة لعزل الحمض النووي الريبي من إعداد كبيرة من الحيوانات. ويرد هنا بروتوكولا لتحليل التعبير الجيني العالمي في الأجنة الزرد استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق). يصف لنا إعداد الجيش الملكي النيبالي من الأجنة كله أو من السكان الخلية التي تم الحصول عليها باستخدام الخلية الفرز في الحيوانات المحورة وراثيا. كما يصف لنا نهج لتحليل البيانات رناسيق لتحديد مسارات المخصب وشروط الجينات علم الوجود (GO) في مجموعات البيانات التعبير الجيني العالمي. وأخيراً، نحن نقدم بروتوكول للتحقق تغييرات التعبير الجيني باستخدام المنتسخة العكسية الكمي PCR (قرت-PCR). يمكن استخدامها لتحليل مقارن للتحكم ومجموعات تجريبية من الزرد لتحديد التغييرات التعبير الجيني رواية هذه البروتوكولات، والتبصير الجزيئية تعمل لمصلحة.
Introduction
تحليل مقارن للتعبير الجيني العالمي أداة قيمة لتحديد الجينات الجديدة المساهمة تعمل الملاحظة. هذه التحليلات عادة تعتمد على التقييم الكمي لوفرة نسخة مقارنة بين التجريبية والتحكم في العينات. النهج المستهدفة، مثل قرة-بكر نسبيا سريعة ودقيقة لتحقيق تغييرات التعبير الجيني واحد. تسلسل الحمض النووي الريبي (رناسيق) يقدم نهجاً واسع النطاق وخالية من فرضية لتحديد التغيرات الهامة في التعبير الجيني بين العينات، مما يجعل الآن معياراً لمثل هذه التحقيقات عبر أنظمة تجريبية.
وظهرت الزرد نموذجا بارزا عبر مجالات أمراض عديدة. وضعت أصلاً لفائدتها في دراسات علم الأحياء التنموي، نظراً للخصوبة العالية والتكلفة المنخفضة نسبيا للصيانة، والاستخدام التجريبي من الزرد تطورت لتشمل طائفة واسعة من تعمل من الجنينية إلى مراحل الكبار، وكذلك مجموعة واسعة من الجزيئات فحوصات1،،من23. في الواقع، هذه المزايا تجعل الدراسات الميكانيكية الجزيئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة بسبب سهولة الحصول على كميات كبيرة من المواد جنبا إلى جنب مع سهولة التلاعب الوراثية والبيئية على السواء في جميع مراحل الحياة. وعلاوة على ذلك، الطبيعة الشفافة لليرقات والأجنة الزرد تجعله مثاليا لتوليد خطوط مراسل المعدلة وراثيا المحددة للخلايا والأنسجة مما يسمح في فيفو التصور لخلية منفصلة السكان4. استغلال هذه الخطوط يسمح تحليل التعبير الجيني العالمي في أنواع الخلايا المعزولة محددة استناداً إلى مراسل الجينات.
وهنا يقدم بروتوكول شامل لتحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام رناسيق بعد ثقافة الأجنة الزرد. التلاعب التجريبية الوراثية، بما في ذلك morpholino (ميسوري)-ضربة قاضية على أساس الجينات عابرة أو تحرير كريسبر بوساطة الجينوم، وقد عرضت في مكان آخر5،،من67. ولذلك نحن التركيز على بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي الريبي من الأجنة كله أو فرز الخلايا المحورة وراثيا معربا عن مراسل متبوعاً بالتحليل الحسابي البسيط للنتائج رناسيق باستخدام أدوات المسار ومصطلحات علم الوجود (GO) الجينات. أخيرا، لقد شملت استراتيجية من أجل التحقق من صحة التغييرات التعبير الجيني بالكمية عكس المنتسخة بكر (قرت-PCR). هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق للأجنة الزرد التعرض لمجموعة واسعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك مقارنة من طفرات وراثية أو الظروف البيئية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويوفر النهج المبينة في هذا البروتوكول استراتيجية فعالة من حيث التكلفة وسريعة نسبيا لتحليل مستوى الترنسكربيتوم للحيوانات كله أو السكان خلية معينة تم فرزها. الزرد يوفر نموذجا مفيداً لهذا النوع من الدراسة بسبب السهولة والسرعة في توليد كميات كبيرة من ابتداء من المواد وسهولة تنفيذ الوراثية ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذا العمل R01DK102001 (N.A.Z.) و P30DK072488 (N.A.Z.) T32DK098107 (T.L.H. و J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
