Simple élimination de Fluorescence de fond dans les tissus cérébraux humains fixés au formol pour la microscopie en Immunofluorescence
Summary
Arrière-plan autofluorescence des échantillons biologiques complique souvent basés sur la fluorescence des techniques d’imagerie, en particulier dans les tissus de postmitotiques humains âgés. Ce protocole décrit comment l’autofluorescence de ces échantillons peut être efficacement enlevé avec une lampe disponible dans le commerce, émettant une lumière diode source vers photobleach l’échantillon avant immunostaining.
Abstract
Immunofluorescence est une méthode couramment utilisée pour visualiser les compartiments subcellulaires et déterminer la localisation des protéines spécifiques au sein d’un échantillon de tissu. Un grand obstacle à l’acquisition d’images de haute qualité immunofluorescence est endogène autofluorescence des tissus causés par des pigments de vieillissement tels que de lipofuscine ou par des procédés de préparation échantillon commun comme la fixation de l’aldéhyde. Ce protocole décrit comment la fluorescence de fond peut être considérablement réduit par le biais de photoblanchiment de l’utilisation de phosphore blanc luminescent baies de diode électroluminescente (del) avant le traitement avec des sondes fluorescentes. L’émission à large spectre de phosphore blanc LED permettre pour la décoloration des fluorophores dans un éventail de pics d’émission. L’appareil de photoblanchiment peut être construits à partir des composants sur étagère à très bas prix et offre une alternative accessible aux extincteurs chimiques disponibles dans le commerce. Un prétraitement de photoblanchiment du tissu suivi classique immunofluorescence souillant génère des images sans fond autofluorescence. Par rapport à mis en place des extincteurs chimiques qui réduit la sonde comme arrière-plan signale, photoblanchiment traitement n’a eu aucun effet sur l’intensité de fluorescence sonde alors qu’elle a effectivement réduit fluorescence de fond et de lipofuscine. Bien que photoblanchiment nécessite plus de temps pour le prétraitement, supérieur intensité LED tableaux peuvent servir à réduire le temps de photoblanchiment. Cette méthode simple peut potentiellement être appliquée à une variété de tissus, tissus particulièrement mitotiques qui s’accumulent lipofuscine tels que le cerveau et les muscles cardiaques ou squelettiques.
Introduction
La microscopie de fluorescence en utilisant des anticorps ciblant les protéines spécifiques est régulièrement utilisée pour visualiser les protéines d’intérêt dans la culture de cellules et de tissus. Une complication majeure à l’acquisition des images claires et définitives en immunofluorescence est autofluorescence, qui peut être causée endogène dans les tissus de mammifères de la lipofuscine de pigment d’âge et de protéines telles que l’élastine et du collagène1, 2. Autres sources d’autofluorescence peuvent être introduits par étapes de préparation d’échantillon comme aldéhyde fixation3. Granules de lipofuscine, composés essentiellement de protéines modifiées par oxydation et résidus de dégradation des lipides, s’accumulent dans les cellules longue durée de vie accrue âge2. Cela provoque des difficultés dans l’imagerie des tissus postmitotiques comme le cerveau et les muscles cardiaques ou squelettiques, comme le spectre d’émission de fluorescence de lipofuscine est large et variable, qui coïncide souvent avec la longueur d’onde d’émission des fluorophores courants utilisés pour 4l’étiquetage. Ces facteurs rendent l’imagerie des tissus cérébraux humains provenant de cas de maladies neurodégénératives tardives comme la dégénérescence lobaire fronto-temporale (FTLD) particulièrement difficile.
Pour réduire l’autofluorescence, nous avons mis au point une technique dans laquelle nous irradier les sections de tissu monté sur glissière avec une lumière blanche émettant réseau de diodes (LED) à l’aide d’une lampe de bureau domestique5. Cette technique simple fournit une alternative aux techniques qui utilisent des extincteurs chimiques telles que CuSO4 dans l’acétate d’ammonium, ou disponible dans le commerce de trempe des colorants tels que le Soudan noir B et noir d’ériochrome T6. Il dispose également d’importante économies sur multispectral conduit techniques de photoblanchiment de lampe et évite les complications et les objets générés à partir des méthodes d’épilation autofluorescence numérique comme spectrale non mélange7,8. Phosphore blanc LEDs ont un large spectre d’émission, une haute luminosité et un coût de fabrication faible, ce qui les rend idéales comme une composante standard de photoblanchiment une variété de chromophores5,9.
Dans ce protocole, nous démontrer la construction d’un appareil de photoblanchiment utilisant des composants accessibles et appliquent le photoblanchiment à un cas de tissu FTLD contenant des inclusions tau-positive (FTLD-T) à l’aide d’un anticorps spécifique de la protéine tau phosphorylée. Nous démontrons l’effet de photoblanchiment sur l’imagerie des anticorps fluorescent marqués employant deux chromophores couramment utilisés : Alexa 488 et Texas Red. L’effet de photoblanchiment versus sections non traitées ou ceux traités avec un extincteur chimique commercial sont quantifiés et comparés. Ce prétraitement photobleaching peut être incorporé à n’importe quel protocole de coloration standard immunofluorescence pour enlever l’autofluorescence dans un échantillon biologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le prétraitement de photoblanchiment de tissus visés dans ce manuscrit permet une élimination effective d’autofluorescence utilisant des composants sur étagère. Le protocole décrit l’imagerie immunofluorescence des agrégats de protéine tau phosphorylée dans les tissus fixés au formol un cerveau humain en utilisant des anticorps secondaires conjugués à Alexa 488 et Texas Red, au DAPI comme contre-colorant nucléaire. Pour appliquer la méthode à d’autres tissus, nous recommandons de procéder à un trai…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée en tout ou en partie par le Consortium canadien de neurodégénérescence et vieillissement (CCNA), l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC), la société de la SLA de SLA (Canada) et la société Alzheimer du Canada (sac). Les auteurs aimeraient remercier Sultan Darvesh et Andrew Reid de la Maritime cerveau Banque de tissus pour fournir les tissus cérébraux FTLD, Gauthier de Milan depuis le programme ciblant les spatio-temporelle et Amplification de rayonnement réponse (STTARR) et ses affiliés bailleurs de fonds pour le tissu l’incorporation et la section des services et le Advanced optique Microscopy Facility (AOMF) pour fournir des instruments de microscopie. Kevin Hadley est remerciée pour l’examen critique du manuscrit.
Materials
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Sodium Choloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Hydrochloric Acid | Caledon Laboratory Chemicals | 1506656 | |
| Sodium Azide | BioShop Canada | SAZ001 | |
| 100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish | Sarstedt | 82.9923.422 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| 6 W LED Dimmable Desk Lamp | DBPower | DS501 | All components of photobleacher can be substituted based on availability |
| Citric Acid | Sigma-Aldrich | C-2404 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop Canada | EDT001 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| Sodium Hydroxide | BioShop Canada | SHY700.1 | |
| Water bath | Haake Fisons | K15 | |
| Slide collector | FisherScientific | 12-587-17B | |
| Staining Jar | FisherScientific | E94 | |
| Orbital Shaker | Bellco Glass | 7744-08115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T7878 | |
| Bovine Serum Albumin | FisherScientific | BP1600-1 | |
| Normal Goat Serum | Aurion | 905.002 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
| Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8) | ThermoFisher | MN1020 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X | ThermoFisher | T862 | |
| Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-11029 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | ThermoScientific | 28-600-42 | |
| Glass soverslip | |||
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | |
| Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0 | Zeiss | LSM710 | Software accompanies the Confocal Microscope |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| RGB Profile Tools macro | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt | |
| Commercial chemical quencher | Biotum | 23007 |
References
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