En flyt cytometri-baserte cytotoksisitet analysen for vurdering av menneskelig NK celle aktivitet
Summary
En flyt cytometri-basert metode å avgjøre kvantitativt cytotoksiske aktiviteten til menneskets naturlige drepe celler er vist her.
Abstract
Innenfor det medfødte immunsystemet spille effektor lymfocyttene kalles naturlig morderen celler (NK) en viktig rolle i vert forsvar mot avvikende celler, spesielt å eliminere tumoral og virally infiserte celler. Ca 30 kjent monogenic feil, sammen med en rekke andre pathological betingelser, forårsake funksjonelle eller klassisk NK celle mangel, manifestert i redusert eller fraværende cytotoksiske aktivitet. Historisk har cytotoksisitet blitt undersøkt med radioaktive metoder, som er tunge, dyre og potensielt farlige. Denne artikkelen beskriver en strømlinjeformet, klinisk gjeldende flyt cytometri-basert metode for å kvantifisere NK celle cytotoksiske aktivitet. I denne analysen, perifert blod mononukleære celler (PBMCs) eller renset NK celle forberedelser er co inkubert på ulike forhold med en mål svulst celle linje kjent for å være følsomme for NK celle-mediert cytotoksisitet (NKCC). Målcellene er forhåndsinnstilte merket med et fluorescerende farge slik at diskriminering fra Effektor celler (celler NK). Etter inkubasjonstiden, er drepte målcellene identifisert av en nukleinsyre flekk, hvilke spesielt gjennomsyrer døde celler. Denne metoden er mottakelig for både diagnose og forskning og, takket være flere parameter egenskapene til flowcytometri, har den ekstra fordelen av potensielt en dypere analyse av NK celle fenotypen og funksjon.
Introduction
Naturlig morderen celler (NK) er et sofistikert delsett av menneskelig medfødte lymfocytter kritisk involvert i eliminasjon av virally infiserte celler, forvandlet celler og andre sykdomsframkallende trusler 1,2. NK celle lytisk granulater huset cytotoksiske proteiner, som perforin og granzymes. Ved aktivering, NK celler danner et komplekst samspill med sine mål kjent som immunologiske synapse, der disse cytolytic molekyler lokalt slippes, direkte målet cellen lyse og apoptose, sammen med cytokin og chemokine og til slutt i innledningen av en provoserende staten 1,3,4.
NK celle aktivering innebærer en omfattende rekke aktivering og hemmende interaksjoner mellom NK celle reseptorer og ligander uttrykt på overflaten av målcellene, danner et strengt regulert system. En av de mest studerte mekanismene av NK celle aktivering er “mangler selv”. Faktisk mangel på deteksjon av klassen jeg major histocompatibility kompleks (MHC), eller menneskelig leukocytter antigen (HLA) molekyler, på infisert eller forvandlet celler utløsere NK celle cytotoksisitet. Svulsten og virus-infiserte celler generelt downregulate disse antigener å unnslippe T celle-mediert immunitet, ble dermed primære NK celle mål 1,3,4.
Vurdering av NK celle funksjon er primært kategorisert i omfatter degranulering eller cytotoksisitet analyser. Omfatter degranulering analyser, for eksempel flyt cytometric gjenkjenning av omfatter degranulering-assosiert merket CD107a, er imidlertid bare indikativ av NK celle aktivering og ikke deres ultimate funksjon, direkte drapet på målet celler 5,6,7,8. Derfor har denne begrensningen trukket etterforskere til cytotoksisitet analyser som en mer forteller og mer direkte alternativ.
Lang tid “gull standard” for å vurdere celle-mediert cytotoksiske aktivitet både T og NK celler er krom utgivelsen analysen (CRA). CRA innebærer radioactively merking av målcellene med 51Cr og co rugende dem med Effektor celler. Denne analysen er gjennomsyret av prinsippet at cellen lysis resulterer i utgivelsen av protein-bundet 51Cr i nedbryting, som kan måles ved gamma teller. Denne analysen, mens effektive, er problematisk for en rekke årsaker: høy materialkostnader, håndtering og deponering av radioaktivt 51Cr, spontane utgivelsen av 51Cr og vanskelig standardisering – gjør det helt upraktisk 9,10.
En rekke ikke-radioaktivt analyser, med fluorescerende merking, enzym utgivelsen og selv bioluminescens, har siden blitt utviklet som alternativer til CRA 11,12,13,14. Her beskriver vi en flyt cytometri-basert metode for måling av NK celle cytotoksiske aktivitet på K562 målet celler som er enkel, følsom og reproduserbar. K562 cellene er en menneskelig erythroleukemic celle linje med redusert uttrykk for HLA klasse jeg og økt uttrykk for ligander for activatory NK reseptorer, noe som gjør dem spesielt utsatt for NK celle-mediert cytotoksisitet 15. I denne analysen, K562 celler pre merket med carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) og co kultivert på ulike prosenter med enten perifert blod mononukleære celler (PBMCs) eller renset NK celler 1. CFSE er en stabil, protein-bindende fluorescerende farge som lar diskriminering av målet celler effektor NK celler 16,17. Etter den co inkubering brukes en nukleinsyre flekk, spesielt gjennomsyre membran av døde celler, til å identifisere drept målcellene (se tabell av materialer). Prøvene er deretter ervervet på en flyt cytometer å finne ut prosentandelen av døde (dvs. flekken +) CFSE + målcellene.
Denne analysen kan brukes som en rutinemessig diagnostiske screening for monogenic feil påvirker NK celle rommet, som det er ca 30 kjent feilene forårsaker funksjonelle eller klassisk NK celle mangel, og for primær eller sekundær hemophagocytic lymphohistiocytosis. Det er også nyttig å undersøke NK celle aktivitet hos pasienter med tilbakevendende, alvorlig herpes virusinfeksjoner, evaluere immune rekonstituering etter blodkreft cellen transplantasjon eller innlegget immunmodulerende terapi 18,19,20, og for en rekke grunnleggende forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet her gir en enkel og kostnadseffektiv alternativ til tradisjonelle 51Cr utgivelsen analysen å vurdere NK celle cytotoksiske aktivitet. Denne metoden er sensitiv, reproduserbare og mindre tidkrevende enn tidligere standard metoder, som CRA, og kan brukes til både klinisk forskning programmer.
Mens analysen fungerer med både total PBMCs og beriket NK celler, er bruke PBMCs uten behov for å rense celle populasjoner en stor fordel når du arbeider med små mengder s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, for henne hjelp manuskriptet forberedelser.
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
