Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano
Summary
Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.
Abstract
Crescimento bacteriano é um conceito central no desenvolvimento da moderna fisiologia microbiana, bem como na investigação da dinâmica celular a nível de sistemas. Estudos recentes têm relatado correlações entre o crescimento bacteriano e eventos de todo o genoma, tais como reorganização de redução e transcriptoma do genoma. Analisar corretamente o crescimento bacteriano é crucial para a compreensão da coordenação de crescimento dependente de gene funções e componentes celulares. Nesse sentido, a avaliação quantitativa precisa de crescimento bacteriano em forma de alto rendimento é necessária. Desenvolvimentos tecnológicos emergentes oferecem novas ferramentas experimentais que permitem atualizações dos métodos utilizados para estudar o crescimento bacteriano. O protocolo introduzido aqui emprega um leitor de microplacas com um procedimento experimental altamente otimizado para a avaliação do crescimento bacteriano preciso e reprodutível. Este protocolo foi utilizado para avaliar o crescimento de vários descrito anteriormente estirpes de Escherichia coli . As principais etapas do protocolo são os seguintes: a preparação de um grande número de ações de célula em pequenos frascos para testes repetidos com resultados reprodutíveis, o uso de placas de 96 poços para avaliação de crescimento elevado-throughput e o cálculo manual de duas principais parâmetros (ou seja, densidade de população e taxa de crescimento máxima) que representa a dinâmica de crescimento. Em comparação com o tradicionais formadoras unidade (CFU) do ensaio, que conta as células que são cultivadas em tubos de vidro ao longo do tempo em placas de ágar, o presente método é mais eficiente e fornece registros temporais mais detalhados das alterações de crescimento, mas tem um mais rigorosas limite de deteção em densidades de população baixas. Em resumo, o método descrito é vantajoso para a análise da elevado-produção precisa e reprodutível de crescimento bacteriano, que pode ser usado para tirar conclusões conceituais ou fazer observações teóricas.
Introduction
Estudos microbiológicos muitas vezes começam com a cultura de células bacterianas e a avaliação das curvas de crescimento bacteriano, que representam um fenômeno fundamental da fisiologia bacteriana1,2,3. Princípios básicos de cultura estão amplamente disponíveis na literatura de pesquisa publicados e livros didáticos, porque a cultura bacteriana é uma metodologia fundamental. No nível do banco, substancial atenção tradicionalmente tem sido focada na otimização de meios de crescimento e condições de cultivo, mas controlando a taxa de crescimento, que provavelmente proporcionará maior compreensão da fisiologia microbiana, não foi extensivamente estudados4. Para bactérias de crescimento exponencial, um parâmetro chave do estado celular é a taxa de crescimento, o que foi relatada para ser coordenado com o genoma, transcriptoma e proteoma5,6,7,8 . Assim, a avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é crucial para a compreensão fisiologia microbiana.
Para avaliar o crescimento bacteriano, os métodos experimentais utilizados para estimar a biomassa são bem estabelecida9,10 e baseiam-se na detecção de parâmetros bioquímicos, físicos ou biológicos, tais como turbidez óptica. Além disso, os métodos analíticos utilizados para capturar as propriedades dinâmicas de mudanças de crescimento comumente são baseados em modelos não-lineares estabelecida11,12,13, por exemplo, as equações logísticas. Dinâmica de crescimento geralmente é adquirida por amostragem cronometrada do crescimento celular em cultura por medição óptica turbidez ou realizando ensaios de unidade (CFU) formadoras. A limitação destes métodos de cultivo e deteção é que os pontos de dados não são um verdadeiro reflexo da dinâmica populacional, porque os intervalos de medição são muitas vezes em horas e a condição da cultura (por exemplo, mudanças na temperatura e aeração) é perturbada no momento da amostragem. Técnicas de cultura e análise devem ser atualizadas usando o desenvolvimentos recentes na tecnologia e na compreensão. Avanços recentes em leitores de microplacas permitem a observação em tempo real de crescimento bacteriano e diminuem significativamente os custos trabalhistas. Usando estes dispositivos avançados, os últimos estudos sobre crescimento bacteriano relataram métodos analíticos para medições de alta produtividade14,15.
O propósito do presente protocolo é avaliar a dinâmica de crescimento precisa de uma forma de alto rendimento, que será valiosa para estudos quantitativos que, finalmente, abordar as questões de como a taxa de crescimento é determinada e que fatores afetam a taxa de crescimento. O protocolo aborda todos os fatores que devem ser tomados em consideração para a quantificação precisa e repetível de crescimento bacteriano. O método experimental e a análise são descritas em detalhes no texto principal. Este método permite a análise precisa e reprodutível de crescimento bacteriano de uma forma de alta produtividade. Microbiologistas podem usar este protocolo para derivar resultados quantitativos adicionais de suas evidências experimentais. Este protocolo também pode ser usado para estudos em biologia de sistemas que tentam tirar conclusões conceituais ou para alcançar uma visão teórica de crescimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos no protocolo incluem a preparação de um estoque comum de células e a replicação das mesmas amostras em vários poços em várias posições na microplate exponencialmente crescentes. Anteriormente, microbiólogos começaram a cultura de uma pre-cultura durante a noite. Enquanto este método pode reduzir o tempo de retardo de crescimento bacteriano, é difícil conseguir-se curvas de crescimento podem ser reproduzidos. Como mostrado na Figura 2, as medições independent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm nada para divulgar.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
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