Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo
Summary
Muchas enfermedades oculares visión-que amenaza se asocian a microvasos retiniana disfuncional. Por lo tanto, la medición de las respuestas de la arteriola retiniana es importante investigar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Este artículo describe un protocolo detallado para ratón arteriola retiniana aislamiento y preparación para evaluar los efectos de sustancias vasoactivas en el diámetro vascular.
Abstract
Insuficiencia vascular y alteraciones en la perfusión retiniana normal están entre los principales factores para la patogenesia de varios avistar-que amenaza enfermedades oculares, como retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva y, posiblemente, glaucoma. Por lo tanto, las preparaciones microvasculares retinianas son herramientas fundamentales para estudios fisiológicos y farmacológicos delinear los mecanismos fisiopatológicos subyacentes y diseño de terapias para las enfermedades. A pesar del amplio uso de modelos murinos en investigación oftálmica, escasean los estudios sobre la reactividad vascular retiniana en esta especie. Una de las principales razones para esta discrepancia es los procedimientos de aislamiento difícil debido al pequeño tamaño de estos vasos sanguíneos retinianos, que es ~ ≤ 30 μm de diámetro luminal. Para evitar el problema de aislamiento directo de estos microvasos retinianas para estudios funcionales, se estableció una técnica de aislamiento y preparación que permite estudios ex vivo de la vasoactividad de retina de ratón bajo condiciones fisiológicas cerca . Aunque la preparación experimental actual se refiere específicamente a las arteriolas retinianas de ratón, esta metodología puede ser fácilmente empleada para microvasos de ratas.
Introduction
Alteraciones en la perfusión retiniana han sido implicados en la patogenia de varias enfermedades oculares, como retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva y el glaucoma1,2,3. Así, estudios para medir la reactividad vascular en la retina son importantes para entender la fisiopatología de estas enfermedades y desarrollar el nuevo tratamiento se acerca.
Debido a la posibilidad de manipulación de genes en el genoma del ratón, el ratón se ha convertido en un modelo animal ampliamente utilizado para los estudios del sistema cardiovascular4. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de los vasos sanguíneos retinianos (≤ 30 μm), medición de la reactividad vascular en la retina del ratón es difícil. Por ejemplo, técnicas estereoscópica para la medición en vivo están limitadas en su resolución óptica y por lo tanto, sólo permiten para detectar exactamente cambios en diámetro o sangre flujo en sangre pequeñas de menos de ≤ 30 μm de diámetro cuando está equipado con sofisticado dispositivos adicionales, tales como un microscopio confocal usando colorantes fluorescentes o la adaptación óptica escaneo luz oftalmoscopio5,6. Por otra parte, la interpretación de en vivo medidas encaminadas a identificar locales señalización mecanismos en los vasos sanguíneos retinianos pueden confundirse por anestésicos, cambios en la presión arterial sistémica y la influencia de los vasos sanguíneos retrobulbares.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método para medir las respuestas de los vasos sanguíneos retinianos ratón con óptica de alta resolución ex vivo. La técnica aquí presentada permite la visualización de arteriolas retinianas mediante transmisión microscopia ligera. Este método, que también puede ser utilizado en ratas, proporciona acceso a las ventajas del gene targeting tecnología en investigación vascular ocular.
Protocol
Representative Results
Discussion
La medición de las respuestas vasculares en la retina del ratón es difícil debido al pequeño tamaño de los vasos sanguíneos retinianos. Con la técnica presentada, arteriolas retinianas se visualizan por microscopia de luz transmitida. Esto es posible, porque la retina aislada es translúcida. La ventaja de la técnica es la alta resolución óptica. La resolución espacial calculada es 11 px/μm. Sin embargo, la resolución real de este sistema óptico que utiliza la luz blanca es entre 200 y 300 nm, que se explic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la und Ernst Berta Grimmke Stiftung y la Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (el perro).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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