Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux
Summary
Cette vidéo montre une procédure pour générer cultures de neurones de l'embryon et au début du cortex de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisées pour l'immunocytochimie, la biochimie, l'électrophysiologie, de calcium et de sodium d'imagerie et de fournir une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du gène létal postnatale.
Abstract
Cette vidéo va vous guider à travers le processus pour générer des cultures de neurones corticaux de l'embryon et au début de cerveau de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisés pour une variété d'applications, y compris immunocytochimie, biochimie, électrophysiologie, d'imagerie du calcium et de sodium, de protéines et / ou d'isolement d'ARN. Ces cultures fournissent également une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du retard embryonnaire ou postnatale gène létal. La procédure est relativement simple, nécessite une certaine expérience dans la technique de culture de tissus et ne devrait pas prendre plus de deux à trois heures si vous êtes bien préparé. Attention séparation de l'écorce corticale par le tractus de fibres thalamo-cortical permettra de réduire le nombre des grossesses non désirées cellules non-neuronales. Pour accroître les rendements des cellules neuronales triturer les pièces du tissu cortical doucement après l'étape d'incubation enzymatique. C'est impératif car elle prévient les blessures inutiles aux cellules et la mort prématurée de cellules neuronales. Étant donné que ces cultures sont maintenues en l'absence de cellules nourricières glie, ils offrent également un avantage supplémentaire de cultures de plus en plus enrichies en neurones.
Protocol
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | ||
| Sodium Chloride | Sigma | S9625 | ||
| Vibraslicer | Campden Instruments Ltd. | |||
| Potassim Chloride | Sigma | P4504 | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S0876 | ||
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5379 | ||
| Hepes | Sigma | H3375 | ||
| D (+)-Glucose | Sigma | G8270 | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | ||
| B27 Supplement | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Neurobasal Media (NBM) | Invirtogen (Gibco) | 21103-049 | ||
| 2-Amino-5-phosphonopentanoic acid | Sigma | A5282 | ||
| Bovine Albumin | Sigma | A7030 | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T9253 | ||
| Sodium Hydroxide, 1N solution | Fisher | SS266-1 | ||
| L-Cysteine | Sigma | C7755 | ||
| Bacto Agar | Difco | 0140-01 | ||
| Papain | Worthington | LS 03126 | ||
| Sterile 0.2 µm Syringe Filter | Fisher | DDA02025S0 | ||
| Glass Coverslips, No1, Ø12mm | Bellco Glass Inc. | 1943-00012 | ||
| Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen (Gibco) | 11090-081 | with Earle’s salts without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | for non-neuronal culture | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Gibco) | 16140-071 | needed for non-neuronal cultures | |
| Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle | Fisher | 12-565-25 | Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead. | |
| Glass bottom “Imaging dishes” | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive! |
