Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.
Abstract
Dieses Video wird Sie durch den Prozess zur Erzeugung von kortikalen neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Gehirn der Maus. Diese Kulturen können für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Imaging-, Protein-und / oder RNA-Isolierung verwendet werden. Diese Kulturen auch eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein Ende der embryonalen oder postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren. Das Verfahren ist relativ einfach, erfordert eine gewisse Erfahrung in der Gewebekultur Technik und sollten nicht länger als zwei Minuten vor drei Stunden, wenn Sie richtig vorbereitet sind. Eine sorgfältige Trennung der kortikalen Rinde von den thalamo-kortikalen Fasern Trakt verringert sich die Anzahl der unerwünschten nicht-neuronalen Zellen. Zur Erhöhung der Erträge von neuronalen Zellen verreiben die Stücke des kortikalen Gewebes sanft nach der Enzyminkubation Schritt. Dies ist zwingend notwendig, da es unnötige Verletzungen verhindert, Zellen und vorzeitigem Zelltod. Da diese Kulturen in der Abwesenheit von Gliazellen Feeder-Zellen gehalten werden, sie bieten auch einen zusätzlichen Vorteil der wachsenden Kulturen in Neuronen angereichert.
Protocol
Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung: Bereiten Sie sterile Sezieren Lösung (DS). Bereiten NBM/B27 (Neurobasal Mediom mit B27-Ergänzungsmittel). Autoclave ddH 2 O und sterilisieren Glas coversilps, wenn nötig. Coat Gewebekulturschalen oder Deckgläser mit Poly-D-Lysin. Poly-D-Lysin-Beschichtung: Bereiten Sie den Tag vor Kultivierung unter sterilen Bedingungen. Thaw Aliquot 10X PDL und auf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine
Sigma
F0503
Sodium Chloride
Sigma
S9625
Vibraslicer
Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride
Sigma
P4504
Sodium Phosphate Dibasic
Sigma
S0876
Potassium Phosphate Monobasic
Sigma
P5379
Hepes
Sigma
H3375
D (+)-Glucose
Sigma
G8270
Sucrose
Sigma
S0389
Poly-D-Lysine
Sigma
P7280
B27 Supplement
Invitrogen (Gibco)
17504-044
Neurobasal Media (NBM)
Invirtogen (Gibco)
21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid
Sigma
A5282
Bovine Albumin
Sigma
A7030
Trypsin Inhibitor
Sigma
T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution
Fisher
SS266-1
L-Cysteine
Sigma
C7755
Bacto Agar
Difco
0140-01
Papain
Worthington
LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter
Fisher
DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm
Bellco Glass Inc.
1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)
Invitrogen (Gibco)
11090-081
with Earle’s salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen (Gibco)
15070-063
for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum
Invitrogen (Gibco)
16140-071
needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle
Fisher
12-565-25
Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”
MatTek Corp.
P35G-1.5-10-C
Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!