Beredning av dissocierade Mouse kortikala Neuron kulturer
Summary
Denna video visar en procedur för att generera neuronala kulturer från slutet av embryot och tidiga postnatala mus cortex. Dessa kulturer kan användas för immuncytokemi, biokemi, elektrofysiologi, kalcium och natrium bildbehandling och tillhandahålla en plattform för att studera nervsystemets utveckling av transgena djur som bär en postnatal dödliga genmutation.
Abstract
Denna video kommer att guida dig genom processen för att skapa kortikala neuronala kulturer från slutet av embryot och tidiga postnatala musen hjärnan. Dessa kulturer kan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive immuncytokemi, biokemi, elektrofysiologi, kalcium och natrium bildbehandling, protein och / eller RNA isolering. Dessa kulturer ger också en plattform för att studera nervsystemets utveckling av transgena djur som bär en sen embryonal eller postnatal dödliga genmutation. Förfarandet är relativt rakt fram, kräver en del erfarenhet av vävnadsodling teknik och bör inte ta längre än två till tre timmar om du är ordentligt förberedd. Noggrann separation av kortikala svålen från thalamo-kortikala fiber tarmkanalen kommer att minska antalet oönskade icke-neuronala celler. För att öka avkastningen av neuronala celler mal sönder bitar av kortikala vävnaden försiktigt efter enzymet inkuberingssteget. Detta är viktigt eftersom det förhindrar onödig skada på celler och för tidig nervcellsdöd. Eftersom dessa kulturer upprätthålls i avsaknad av celler Glia feeder, de erbjuder även en extra fördel att växa kulturer anrikas i nervceller.
Protocol
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | ||
| Sodium Chloride | Sigma | S9625 | ||
| Vibraslicer | Campden Instruments Ltd. | |||
| Potassim Chloride | Sigma | P4504 | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S0876 | ||
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5379 | ||
| Hepes | Sigma | H3375 | ||
| D (+)-Glucose | Sigma | G8270 | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | ||
| B27 Supplement | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Neurobasal Media (NBM) | Invirtogen (Gibco) | 21103-049 | ||
| 2-Amino-5-phosphonopentanoic acid | Sigma | A5282 | ||
| Bovine Albumin | Sigma | A7030 | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T9253 | ||
| Sodium Hydroxide, 1N solution | Fisher | SS266-1 | ||
| L-Cysteine | Sigma | C7755 | ||
| Bacto Agar | Difco | 0140-01 | ||
| Papain | Worthington | LS 03126 | ||
| Sterile 0.2 µm Syringe Filter | Fisher | DDA02025S0 | ||
| Glass Coverslips, No1, Ø12mm | Bellco Glass Inc. | 1943-00012 | ||
| Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen (Gibco) | 11090-081 | with Earle’s salts without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | for non-neuronal culture | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Gibco) | 16140-071 | needed for non-neuronal cultures | |
| Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle | Fisher | 12-565-25 | Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead. | |
| Glass bottom “Imaging dishes” | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive! |
