Сдвигая данио рерио смертоносных скелетных мутант пенетрантностью потомства тестирование
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в изменить пенетрантностью смертоносных скелетных мутант фенотипы в zebrafish путем селекции. Смертельной Мутанты не может быть выращен до совершеннолетия и разводят сами, поэтому этот протокол описывает метод для отслеживания и выбирая пенетрантностью через несколько поколений потомства тестирования.
Abstract
Zebrafish мутант фенотипов часто неполно капиллярный, только проявляется в некоторых мутантов. Интересно фенотипов, отображаются непоследовательно может быть трудным для изучения и может привести к смешанным результатам. Протокол, описанные здесь это просто разводить парадигма для увеличения и уменьшения пенетрантностью в смертельной данио рерио скелетных мутантов. Потому что напрямую нельзя выборочно разводили смертоносных мутантов, используется классический селекции стратегия тестирования потомства. Этот метод также включает протоколы для Kompetitive аллеля конкретного ПЦР (KASP) генотипирования данио рерио и окрашивание личиночной данио рерио хряща и кости. Применение стратегии земледелия, описанные здесь может увеличить пенетрантностью интересные скелетных фенотип, позволяя более воспроизводимые результаты в нисходящие приложения. Кроме того уменьшение мутант пенетрантностью через эту стратегию селекции может выявить процессы развития, которые наиболее критически требуют функции мутировавших генов. В то время как скелет конкретно рассматривается здесь, мы предлагаем, что эта методология будет полезным для всех zebrafish мутант линий.
Introduction
Данио рерио — это система мощная модель для понимания развития скелета. Штаммами zebrafish мутант биологи могут расшифровать функции гена во время skeletogenesis. Данио рерио скелетных мутант фенотипов может представлять, с переменной пенетрантностью2,1,3,4 , которые могут препятствовать развития и генетические анализы. Назначение этого метода в три раза. Во-первых генерации zebrafish мутант линии, которые постоянно производить серьезные фенотипов позволяет течению развития исследований как покадровой записи5 и трансплантации6. Эти виды исследований могут калекой, пытаясь изучить фенотипов, которые только манифест непоследовательно. Во-вторых инбридинг данио рерио штаммы могут уменьшить вариации генетический фон, содействуя тем самым экспериментальной согласованность и воспроизводимость. Например выполняя все на месте гибридизации анализы на одном выборочно инбредных деформации может уменьшить накладывающееся изменчивости и укреплять выводы. В-третьих генерации тяжелой и легкой штаммов покажет весь фенотипические серии, которая может быть результатом конкретной мутации.
На первый взгляд селекция смертоносных мутантов кажется невозможным. Как может одна порода для пенетрантностью когда мертвых животных, которые подсчитываются для отбора? К счастью методы селекции семьи выбор, специально потомства тестирования, продемонстрировали эффективность животноводства программы для многих лет7,8. Эти программы используются главным образом для селекционных признаков, которые присутствуют только в одном сексе, как производство молока коров или производство яиц в кур. Самцов этих видов не забил непосредственно, но забил их потомства и значение затем назначается для родителей. Заимствование из этой стратегии, протокола, представленные здесь включает озвучивание фиксированной и окрашенных мутант потомство от пары данио рерио, гетерозиготных для мутантного гена интереса. Пенетрантностью фенотип в гомозиготной смертоносных мутантов потомство назначается родителям при принятии решения, какие лица будет производить следующее поколение в линии. Мы считаем, что этот метод является эффективным средством перехода пенетрантностью в zebrafish смертоносных мутантов скелетных1.
Аналогично для других исследований, этот протокол селекции принимает под рассмотрение критериев, как размер сцепления, выживание потомства, нормальное развитие эмбрионов и соотношение полов9. Однако эти факторы считаются в контексте мутант фона с целью перехода мутант пенетрантностью. Таким образом этот протокол расширяет предыдущий селекции парадигмы, предлагая метод для укрепления развития мутант анализов, а также повышения однородности фона.
Этот протокол требует обширных генотипирования, поэтому важно заранее разработать надежный, быстрый генотипирования протокол. Существует много генотипирования протоколов доступна в10,11, однако мы находим KASP генотипирования12,,1314 стоимость быстрее, более эффективным и более надежным, чем методы на основе энзима ограничения расщепления усиливается последовательности10. Таким образом мы включать KASP протокол в этой работе. Кроме того мы ориентируемся на скелетные мутант фенотипы в этом протоколе и включать процедуры для Альциановый синий/ализарин красный пятнать изменение от предыдущих протоколов15.
Метод, описанный здесь является простой стратегией для смещения смертоносных мутантов пенетрантностью, вверх или вниз. Хотя этот протокол посвящен скелетных мутант фенотипов, мы считаем, что она будет полезной стратегией для земледелия всех мутантов данио рерио линий. В самом деле полезность этой стратегии разведения вероятно, выходит за рамки данио рерио. Мы прогнозируем, что этот протокол может быть изменено перенести пенетрантностью в широком диапазоне организмов. Сдвигая смертоносных пенетрантностью потомства тестирование может помочь продвигать прогресс любого развития генетик.
Protocol
Representative Results
Discussion
Селекция раскрывает тонкости функции гена
Переход мутант фенотипов быть более или менее серьезные по селекции является простым способом получить новое понимание функции гена. По сравнению со стандартными методами невыбранном селекции, протокола, представлен?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Чак Kimmel для руководства, Джон Dowd за помощь в разработке этой стратегии разведения, Macie Walker для ее работы в области совершенствования скелетных пятно и Charline Уокер и Бонни Ullmann для данио рерио полезные советы. Эта работа была поддержана K99/R00 DE024190 к JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
