Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

Summary

Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.

Abstract

Poisson zèbre phénotypes mutants sont souvent incomplètement par ressuage, se manifestant uniquement chez certains mutants. Des phénotypes intéressants qui apparaissent de manière irrégulière peuvent être difficiles à étudier et peuvent mener à la confusion des résultats. Le protocole décrit ici est un paradigme de reproduction simple pour augmenter ou diminuer la pénétrance chez les mutants squelettique létale de poisson-zèbre. Parce que des mutants létaux ne peuvent être sélectivement directement, la stratégie de reproduction sélective classique des tests de descendance est employée. Cette méthode comprend également les protocoles pour Kompetitive allèle spécifique PCR (KASP) génotypage poisson zèbre et coloration larves de poisson zèbre cartilage et OS. Application de la stratégie d’élevage décrite ici peut augmenter la pénétrance d’un phénotype squelettique intéressant permettant des résultats plus reproductibles dans les applications en aval. En outre, diminuant la pénétrance mutante grâce à cette stratégie de reproduction sélective peut révéler les processus de développement qui nécessitent surtout la fonction du gène muté. Le squelette est considérée comme plus précisément ici, nous proposons que cette méthodologie sera utile pour toutes les lignées mutantes de poisson-zèbre.

Introduction

Le poisson-zèbre est un système puissant modèle pour comprendre le développement du squelette. Avec des souches mutantes de poisson-zèbre, les biologistes peuvent déchiffrer la fonction du gène au cours de la formation squelettique. Cependant, les phénotypes mutants squelette de poisson-zèbre peuvent présenter avec une pénétrance variable^1,2,3,4 qui peut gêner les analyses génétiques et de développement. Le but de cette méthode est triple. Tout d’abord, générant zebrafish lignées mutantes qui produisent régulièrement des phénotypes sévères p....

Protocol

toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été achevés en conformité et le respect de l’Université du Colorado et de l’Université de l’Oregon animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC).

1. préparer le Stock de départ non sélectionnés

1. Identify hétérozygotes porteurs de l’allèle mutant d’intérêt par la nageoire clip ¹¹ et génotypage un stock d’animaux plein-frère par une méthode de choix, tels que KASP ^{12 , 13 , 14}. Ce protocole a été réalisé avec la souche de mef2ca ^b10....

Results

Ce protocole est une technique d’élevage à long terme utile pour les mutants de squelette de poisson-zèbre de compréhension (Figure 1). Élevage sélectif en testant la progéniture devrait produire un changement dans une pénétrance globale aussi bien vers le bas et vers le hausse dans quelques générations (Figure 2). Dans nos travaux précédents, deux cycles de reproduction sélective a roulé la pénétrance moyenne à la baisse de 17 %.......

Discussion

Élevage sélectif dévoile les subtilités de la fonction du gène

Déplacement des phénotypes mutants pour être plus ou moins graves par reproduction sélective est un moyen simple pour acquérir de nouvelles connaissances en fonction des gènes. En comparaison avec des méthodes normalisées de reproduction non sélectionnée, le protocole présenté ici peut donner une compréhension plus complète des phénotypes mutants. Plus précisément, en générant des souches qui sont graves, toute l’é.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldéhyde, granulé, solide	Ted Pella Co.	granulé 18501	est une alternative plus sûre au chlorure de magnésium PFA en poudre
, solide	Acros Organics	223210010
10x PBS,	pêcheur	BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solide	Anatech Ltd.	867	Doit provenir d’Anatech
Alizarin Red, solide	Sigma	A5533-25G
Glycérol, liquide	Fisher	BP229 1
Peroxyde d’hydrogène, liquide	Fisher	BP263500
Hydroxyde de potassium, solide	Fisher	P250 500
StepOnePlus Machine de PCR en temps réel	Applied Biosystems
Plaque de réaction optique rapide à 96 puits MicroAmp avec code-barres (0,1 ml)	Applied Biosystems	4346906
Sceau Microseal 'B'	BioRad	MSB1001
KASP Master Mix, élevé ROX	LGC	KBS-1016-022	https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix	LGC	KBS-2100-100
Tris HCl, solide	Fisher	BP153 500
chlorure de potassium, solide	Fisher	BP366 500
Tween-20, liquide	Fisher	BP337 100
Nonidet P40	ThermoFisher	28324
Tricaine-S	Western Chemicals
Proteinase K	Fisher	BP1700 100
Thermocycleur T100	BioRad	1861096
Chute contrôlée Pasteur	Pipets Fisher	13-678-30
Nanodrop	ThermoFisher		pour la quantification de l’ADN