הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.
Abstract
דג זברה מוטנטים פנוטיפים לעיתים קרובות שהיישום penetrant, מתבטא רק בכמה מוטציות. מעניין פנוטיפים המופיעים באופן בלתי עקבי יכול להיות קשה ללמוד, יכול להוביל משתנה מתערב תוצאות. פרוטוקול המתואר כאן הוא פרדיגמה הרבייה פשוטה כדי להגדיל או להקטין penetrance של מוטציות שלד דג זברה קטלני. כי מוטציות קטלני לא יכול להיות bred סלקטיבי ישירות, האסטרטגיה הקלאסי ברירה מלאכותית של רומא בדיקות הוא מועסק. שיטה זו כוללת גם פרוטוקולים עבור דג זברה genotyping Kompetitive אלל PCR ספציפיים (KASP), צביעת דג זברה זחל סחוס ועצם. יישום האסטרטגיה גידול שמתואר כאן יכול להגביר את penetrance של פנוטיפ השלד מעניין הפעלת עוד תוצאות לשחזור ביישומים במורד הזרם. בנוסף, הפחתת את penetrance מוטציה באמצעות אסטרטגיה זו ברירה מלאכותית יכול לחשוף תהליכים התפתחותיים רוב מכריע דורשות בפונקציה של גן שעבר מוטציה. בעוד השלד במיוחד נחשב כאן, אנו מציעים כי מתודולוגיה זו יהיה שימושי עבור כל השורות דג זברה מוטנטים.
Introduction
דג זברה היא מערכת מודל רב עוצמה להבנת התפתחות השלד. עם דג זברה מוטנטים זנים, ביולוגים יכולה לפענח תפקוד הגן במהלך skeletogenesis. עם זאת, דג זברה מוטנטים פנוטיפים השלד יכול להציג עם משתנה penetrance1,2,3,4 אשר יכול לעכב ניתוחים גנטיים ובעיות התפתחותיות. מטרת שיטה זו הוא פי שלושה. ראשית, יצירת קווי מוטציה דג זברה אשר מייצרים באופן עקבי פנוטיפים חמור מאפשר מחקרים התפתחותיים במורד הזרם כמו הקלטה זמן לשגות5 והשתלת6. אלה מיני מחקרים, יכול להיות נכה-ניסיון ללמוד פנוטיפים רק לידי ביטוי באופן בלתי עקבי. שנית, הניחוש הראשון שלי דג זברה זנים יכול להפחית וריאציה הרקע הגנטי, ובכך לקדם הפארמצבטית והעקביות ניסיוני. לדוגמה, ביצוע כל רגע בחיי עיר הכלאה ניתוחים על זן טבעי סלקטיבי אחד יכול להפחית את השתנות מבלבלים ולחזק את המסקנות. שלישית, יצירת זנים קשות ורכות תחשוף את הסידרה פנוטיפי כולה יכולה לנבוע מוטציה מסוימת.
במבט ראשון, ברירה מלאכותית של מוטציות קטלני נראה בלתי אפשרי. איך זן אחד של penetrance כאשר בעלי החיים הם הבקיע עבור הבחירה מתים? למרבה המזל, שיטות ריבוי סלקטיבי לפי בחירה משפחה, במיוחד רומא בדיקות, הדגימו יעילות תוכניות עבור שנים רבות7,8לגידול בעלי חיים. תוכניות אלה משמשים בעיקר מלאכותית עבור התכונות קיימים רק מין אחד, כמו ייצור החלב בפרות או ייצור הביצים של התרנגולות. הזכרים של המינים הללו לא הבקיע ישירות, אבל הצאצאים שלהם הם הבקיע, לאחר מכן, ערך מוקצית עם ההורים. מגזרים של אסטרטגיה זו, פרוטוקול המובאת כאן כרוכה הבקיע את קבוע, מיטה צאצא מוטציה של זוג דג זברה כי הם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הגן המוטנטי עניין. Penetrance של הפנוטיפ של צאצא מוטציה קטלנית homozygous מוקצה ההורים כאשר מחליטים אנשים אשר יהיה לייצר את הדור הבא של הקו. אנו מוצאים כי שיטה זו היא אמצעי יעיל של הסטה penetrance דג זברה מוטנטים השלד קטלני1.
בדומה מחקרים אחרים, פרוטוקול ריבוי סלקטיבי זה לוקח תחת שיקול קריטריונים כמו גודל תטולה, ההישרדות של הצאצאים, התפתחות תקינה של העוברים, יחס9. עם זאת, גורמים אלו כל נחשבים בהקשר של רקע מוטציה עם המטרה של הסטה של penetrance מוטציה. לכן, פרוטוקול זה מרחיב פרדיגמות מלאכותית הקודם על-ידי המציע שיטה כדי לחזק ניתוחים מוטציה התפתחותית, כמו גם להגביר את הרקע הומוגניות.
פרוטוקול זה דורש genotyping נרחב, לכן חשוב לפתח פרוטוקול אמין, מהיר genotyping מראש. ישנם רבים genotyping הפרוטוקולים הזמינים10,11, עם זאת אנו מוצאים את KASP genotyping12,13,14 הוא מהיר יותר, עלות גבוהה יותר יעילה ואמינה יותר מאשר שיטות מבוסס על אנזים הגבלה המחשוף של רצפי מוגבר10. לכן, אנו כוללים את פרוטוקול KASP בעבודה זו. בנוסף, אנו מתמקדים השלד פנוטיפים מוטציה בפרוטוקול זה, לכלול הליך של אדום כחול/Alizarin Alcian מכתים ששונה בין הפרוטוקולים הקודמים15.
השיטה המתוארת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור העברת penetrance מוטציה קטלנית כלפי מעלה או כלפי מטה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד פנוטיפים מוטציה השלד, אנו מאמינים שזה יהיה שימושי אסטרטגיה האחזקה של כל הקווים דג זברה מוטנטים. למעשה, התועלת של אסטרטגיה זו רבייה סביר חורג דג זברה. אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להזיז penetrance במגוון רחב של אורגניזמים. הסטה penetrance קטלני על-ידי בדיקת רומא יכול לעזור לדחוף קדימה את ההתקדמות של כל חוקר גנטיקה התפתחותית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ברירה מלאכותית חשפה הדקויות של הפונקציה ג’ין
הסטה פנוטיפים מוטציה כדי להיות יותר או פחות חמור על ידי ברירה מלאכותית היא דרך פשוטה לקבל תובנות חדשות הגן פונקציה. כאשר לעומת בשיטות סטנדרטיות של גידול שלא נבחרו, פרוטוקול המובאת כאן יכולות להניב הבנה יותר מלאה של פנוט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות צ’אק קימל להדרכה, ג’ון דאוד לעזרה בפיתוח אסטרטגיה זו רבייה, ווקר Macie שלה לעבודה בלשפר את הכתם השלד, ואת Charline ווקר בוני אולמן לעצות מועילות דג זברה. עבודה זו נתמכה על ידי K99/R00 DE024190 כדי JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
