Skiftende sebrafisk dødelige skjelettlidelser Mutant Penetrance av avkom Testing
Summary
Målet med denne protokollen er å endre penetrance av dødelige skjelettlidelser mutant fenotyper i sebrafisk ved selektiv avl. Dødelige mutanter kan dyrkes til voksen og bred seg, derfor denne protokollen beskriver en metode for sporing og velge penetrance gjennom flere generasjoner av avkom testing.
Abstract
Sebrafisk mutant fenotyper er ofte ufullstendig penetrant, bare manifestert i noen mutanter. Interessant fenotyper som inkonsekvent vises kan være vanskelig å studere, og kan føre til confounding resultater. Protokollen beskrevet her er en enkel avl paradigmet for å øke og redusere penetrance i dødelige sebrafisk skjelettlidelser mutanter. Fordi dødelige mutanter ikke kan være selektivt avlet direkte, brukes den klassiske selektive formering strategien avkom testing. Denne metoden inneholder også protokoller for Kompetitive allelet bestemt PCR (KASP) genotyperingteknologi sebrafisk og flekker larver sebrafisk brusk og bein. Bruke dyrehold strategi beskrevet her kan øke penetrance av en interessant skjelettlidelser fenotypen aktivere flere reproduserbar resultater i nedstrøms programmer. I tillegg kan reduserer det muterte penetrance gjennom denne selektiv formering strategi avsløre utviklingsprosesser som krever mest avgjørende funksjonen av muterte genet. Skjelettet er spesielt som her, foreslår vi at denne metodikken vil være nyttig for alle sebrafisk mutant linjer.
Introduction
Sebrafisk er en effektiv modell for å forstå utvikling av skjelettet. Med mutant sebrafisk stammer, kan biologer dechiffrere gen funksjon under skeletogenesis. Imidlertid kan sebrafisk skjelettlidelser mutant fenotyper presentere med variabel penetrance1,2,3,4 som kan hindre utviklingsmessige og genetiske analyser. Formålet med denne metoden er tredelt. Først kan generere sebrafisk mutant linjer som konsekvent produserer alvorlig fenotyper nedstrøms utviklingsmessige studier som tid-lapse innspillingen5 og transplantasjon6. Disse slags studier kan bli ødelagt av prøver å studere fenotyper som bare inkonsekvent. Andre kan inbreeding sebrafisk stammer redusere genetisk bakgrunn variasjon, dermed fremme eksperimentelle konsistens og reproduserbarhet. For eksempel kan alle i situ hybridisering analyser på en selektivt innavlet belastning redusere forvirrende variasjon og styrke konklusjoner. Tredje vil genererer alvorlig og milde stammer avdekke hele fenotypiske serien som kan følge av en bestemt mutasjon.
Ved første øyekast, virker selektiv formering dødelige mutanter umulig. Hvordan kan en rase for penetrance når dyrene som scoret for valg er døde? Heldigvis har metoder for selektiv formering av familien utvalg, spesielt avkom testing vist effektivitet i husdyr programmer for mange år7,8. Disse programmene brukes hovedsakelig for selektiv formering for egenskaper som finnes bare i ett kjønn, som melk produksjon i kyr eller eggproduksjon i hens. Menn av disse artene kan være scoret direkte, men deres avkom scoret og verdien tilordnes deretter til foreldrene. Låne fra denne strategien, omfatter protokollen presenteres her scoring faste og farget mutant avkom fra et par sebrafisk som er heterozygote for en muterte genet av interesse. Penetrance av en fenotypen i homozygous dødelig mutant avkom er tildelt foreldrene når du bestemmer hvilke personer vil produsere neste generasjon i linjen. Vi finner at denne metoden er et effektivt middel for skiftende penetrance i sebrafisk dødelige skjelettlidelser mutanter1.
I likhet med andre studier, denne selektiv formering protokollen tar under vurdering kriterier som clutch størrelse, overlevelse av avkom, normal utvikling av embryo og sex ratio9. Men er disse faktorene alle vurdert i sammenheng med en mutant bakgrunn med sikte på å skifte den muterte penetrance. Derfor varer denne protokollen tidligere selektiv formering paradigmer tilbyr en metode for å styrke developmental mutant analyser samt øke bakgrunnen homogenitet.
Denne protokollen krever omfattende genotyperingteknologi, så det er viktig å utvikle en pålitelig, rask genotyperingteknologi protokoll på forhånd. Det er mange genotyperingteknologi protokoller tilgjengelig10,11, men vi finner de KASP genotyperingteknologi12,13,14 koster raskere, mer effektiv og mer pålitelig enn metoder basert på begrensning enzym cleavage forsterket sekvenser10. Derfor inkludere vi en KASP protokoll i dette arbeidet. I tillegg vi fokusere på skjelettlidelser mutant fenotyper i denne protokollen og inkludere en prosedyre for Alcian blå/Alizarin rød flekk endret tidligere protokoller15.
Metoden beskrevet her er en enkel strategi for skiftende dødelige mutant penetrance oppover eller nedover. Mens denne protokollen fokuserer på skjelettlidelser mutant fenotyper, tror vi det vil være en nyttig strategi for dyrehold alle mutant sebrafisk linjer. Faktisk nytten av dette avl strategi sannsynlig strekker seg utover sebrafisk. Vi spår at denne protokollen kan endres for å skifte penetrance i et bredt spekter av organismer. Skiftende dødelige penetrance avkom tester kan hjelpe push fremover fremdriften for alle utviklingsmessige genetiker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiv formering avsløre nyanser av gen funksjon
Skiftende mutant fenotyper å være mer eller mindre alvorlige av selektiv formering er en grei måte å få ny innsikt i gen funksjon. Sammenlignet med standard metoder for umerkede avl, kan protokollen presenteres her gi en mer komplett forståelse av mutant fenotyper. Spesielt ved å generere stammer som er alvorlige, kan den fulle bredden av mutant fenotyper bli avslørt, inkludert noen som var unobservable med umerkede a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Chuck Kimmel for veiledning, John Dowd for hjelp i å utvikle denne avl strategi, Macie Walker for sitt arbeid i å perfeksjonere skjelettlidelser flekken, og Charline Walker og Bonnie Ullmann for nyttig sebrafisk råd. Dette arbeidet ble støttet av K99/R00 DE024190 til JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
