Mudando a Penetrância em Zebrafish com mutações esquléticas letais por testes na progênie
Summary
O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.
Abstract
Zebrafish fenótipos mutantes são frequentemente incompleta penetrante, manifestando-se apenas em alguns mutantes. Fenótipos interessantes que aparecem de forma inconsistente podem ser difícil de estudar e podem levar a confundir os resultados. O protocolo descrito aqui é um paradigma de reprodução simples para aumentar e diminuir penetrância em mutantes esquelético zebrafish letal. Porque os mutantes letais não podem ser seletivamente criados diretamente, a estratégia de reprodução seletiva clássico de teste de progênie é empregada. Esse método também inclui protocolos para Kompetitive alelo específico do PCR (KASP) genotipagem zebrafish e coloração zebrafish larval de cartilagem e osso. Aplicar a estratégia de criação descrita aqui pode aumentar a penetrância de um fenótipo esquelético interessante, permitindo que mais resultados reprodutíveis em aplicações a jusante. Além disso, diminuindo a penetrância mutante através desta estratégia de reprodução seletiva pode revelar os processos de desenvolvimento que requerem mais crucialmente a função do gene mutado. Enquanto o esqueleto é especificamente considerado aqui, propomos que esta metodologia será útil para todas as linhas mutantes zebrafish.
Introduction
O peixe-zebra é um sistema poderoso modelo para a compreensão do desenvolvimento esquelético. Com cepas mutantes zebrafish, biólogos podem decifrar a função dos genes durante a skeletogenesis. No entanto, zebrafish esquelético fenótipos mutantes podem apresentar com penetrância variável1,2,3,,4 que pode dificultar as análises genéticas e do desenvolvimento. A finalidade desse método é triplo. Primeiro, gerar zebrafish linhas mutantes que consistentemente produzem fenótipos graves permite a jusante do desenvolvimento estudos como lapso de tempo de gravação transplantação de5 e6. Esses tipos de estudos podem ficar inválidos ao tentar estudar fenótipos que apenas manifestam inconsistentemente. Em segundo lugar, consanguinidade zebrafish cepas pode diminuir a variação do fundo genético, promovendo assim a reprodutibilidade e consistência experimental. Por exemplo, realizando todos os em situ podem reduzir variabilidade confundimento e reforçar conclusões análises de hibridação em uma estirpe seletivamente pura. Em terceiro lugar, gerar tensões graves e suaves irá revelar toda a série fenotípica que pode resultar de uma mutação específica.
À primeira vista, a reprodução seletiva de mutantes letais parece impossível. Como pode uma raça para penetrância quando os animais que são marcados para seleção estão mortos? Felizmente, métodos de reprodução seletiva por seleção de família, especificamente a descendência testes, demonstraram eficácia na pecuária programas para muitos anos7,8. Estes programas são usados principalmente para reprodução seletiva para os traços que só estão presentes em um sexo, como a produção de leite em vacas ou produção de ovos em galinhas. Os machos destas espécies não podem ser marcados diretamente, mas seus descendentes são marcados e um valor é atribuído aos pais. Endividamento a partir desta estratégia, o protocolo aqui apresentado envolve marcando o fixo e manchados mutante prole de um par de zebrafish que são heterozigotos para um gene mutante de interesse. A penetrância de um fenótipo na prole mutantes letais homozigotos é atribuída aos pais quando decidir quais indivíduos irão produzir a próxima geração da linha. Achamos que este método é um meio eficaz de deslocamento penetrância em zebrafish mutantes esquelética letal1.
Similar a outros estudos, este protocolo de reprodução seletiva leva sob critérios de consideração como tamanho da embreagem, sobrevivência da prole, normal desenvolvimento de embriões e uma relação de sexo9. No entanto, esses fatores são considerados no contexto de um fundo mutante com o objetivo de desviar a penetrância mutante. Portanto, este protocolo amplia paradigmas anteriores de reprodução seletiva, oferecendo um método para fortalecer as análises mutantes do desenvolvimento, bem como aumentar a homogeneidade de fundo.
Este protocolo requer genotipagem extensa, por isso é importante desenvolver um protocolo confiável, rápida genotipagem com antecedência. Existem muitos genotipagem protocolos disponíveis10,11, no entanto, encontramos o KASP genotipagem12,13,14 é mais rápido, de custo mais eficiente e mais confiável do que os métodos baseada na clivagem de enzima de restrição de sequências amplificadas10. Portanto, nós incluímos um protocolo KASP neste trabalho. Além disso, podemos focar esqueléticos fenótipos mutantes neste protocolo e incluir um procedimento para Alcian Blue/alizarina Red coloração modificada de anteriores protocolos15.
O método descrito aqui é uma estratégia simples para comutação penetrância mutante letal para cima ou para baixo. Enquanto este protocolo incide sobre fenótipos mutantes esqueléticos, acreditamos que vai ser uma estratégia útil para a criação de todas as linhas de zebrafish mutante. De fato, a utilidade desta estratégia de reprodução provável estende-se além do zebrafish. Prevemos que este protocolo pode ser modificado para deslocar penetrância em uma ampla gama de organismos. Penetrância letal de movimento através do teste de progênie pode ajudar a impulsionar o progresso de qualquer geneticista do desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reprodução seletiva revela sutilezas da função dos genes
Deslocando os fenótipos mutantes para ser mais ou menos grave por reprodução seletiva é uma maneira simples de ganhar novos insights sobre a função do gene. Quando comparado com os métodos padrão de reprodutores selecionados, o protocolo apresentado aqui pode render uma compreensão muito mais completa dos fenótipos mutantes. Especificamente, gerando tensões que são graves, a amplitude total dos fenótipos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Chuck Kimmel para orientação, John Dowd para ajudar a desenvolver esta estratégia de reprodução, Macie Walker por seu trabalho em aperfeiçoar a mancha esquelética e Charline Walker e Bonnie Ullmann para conselhos úteis zebrafish. Este trabalho foi financiado pelo DE024190 K99/R00 para JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
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