Skiftande zebrafiskar dödliga skelett Mutant penetrans av avkommeprövning
Summary
Målet med detta protokoll är att förändra penetrans av dödliga skelett mutant fenotyper i zebrafisk genom selektiv avel. Dödliga mutanter inte kan odlas till vuxen ålder och födde upp själva, därför det här protokollet beskriver en metod för spårning och välja penetrans genom flera generationer av avkommeprövning.
Abstract
Zebrafiskar mutant fenotyper är ofta ofullständigt penetrant, endast manifesterar i vissa mutanter. Intressant fenotyper som inkonsekvent visas kan vara svåra att studera, och kan leda till confounding resultat. Protokollet beskrivs här är en enkel avel paradigm att öka och minska penetrans i dödliga zebrafiskar skelettet mutanter. Eftersom dödliga mutanter inte betäckas selektivt direkt, är klassiska selektiv avel strategi avkomma testning anställd. Denna metod har även protokoll för Kompetitive allel specifika PCR (KASP) genotypning zebrafiskar och färgning larval zebrafiskar brosk och ben. Tillämpa strategin djurhållning som beskrivs här kan öka penetrans av en intressant skelett fenotyp som möjliggör fler reproducerbara resultat i efterföljande program. Dessutom kan minskar den muterade penetrans genom selektiv avel strategin avslöja de utvecklingsprocesser som viktigast kräver funktionen av den muterade genen. Medan skelettet anses särskilt här, föreslår vi att denna metod kommer att vara användbar för alla zebrafiskar mutant rader.
Introduction
Zebrafiskar är en kraftfull modell för förstå skelett utveckling. Med muterade zebrafiskar stammar, kan biologer dechiffrera geners funktion under skeletogenesis. Dock kan zebrafiskar skelett mutant fenotyper presentera med variabel penetrans1,2,3,4 som kan hindra utvecklingsmässiga och genetiska analyser. Syftet med denna metod är trefaldig. Först kan radgenerering zebrafiskar mutant som konsekvent producerar svår fenotyper nedströms utvecklande studier som time-lapse recording5 och transplantation6. Dessa typer av studier kan vara lamslagen av försöker studera fenotyper som bara manifesterar inkonsekvent. För det andra, inavel zebrafiskar stammar kan minska genetiska bakgrunden variation, vilket främjar experimentella konsekvens och reproducerbarhet. Till exempel kan utför alla i situ hybridisering analyser på ett selektivt inavlade stammen minska störande variabilitet och stärka slutsatser. För det tredje, generera svåra och lindriga stammar kommer att avslöja hela fenotypiska serien som kan resultera från en viss mutation.
Vid första anblicken, verkar selektiv avel av dödliga mutanter omöjligt. Hur kan en ras för penetrans när djuren som är gjorde för urval är döda? Metoder för selektiv avel av familjen urval, särskilt avkommeprövning, har lyckligtvis visade effektivitet i boskapsuppfödning program för många år7,8. Dessa program används främst för selektiv avel för egenskaper som endast är tillgängliga i ett kön, som mjölkproduktionen hos kor eller Äggproduktionen i hönor. Manlina av dessa arter kan inte vara poängsätts direkt, men deras avkomma poängsätts och ett värde tilldelas sedan föräldrarna. Upplåning från denna strategi, innebär protokollet presenteras här scoring fasta och färgade muterade avkomman från ett par zebrafiskar som är heterozygota för en mutant gen av intresse. Penetrans av en fenotyp i homozygot dödliga muterade avkomman tilldelas till föräldrarna när man beslutar vilka individer kommer att producera nästa generation i raden. Vi tycker att denna metod är ett effektivt medel för skiftande penetrans i zebrafiskar dödliga skelett mutanter1.
Liknar andra studier, selektiv avel protokollet tar under övervägande kriterier som koppling storlek, överlevnad hos avkomman, normal utveckling av embryon och könskvot9. Men betraktas dessa faktorer inom ramen för en mutant bakgrund med målet att skifta den muterade penetrans. Därför utökar detta protokoll tidigare selektiv avel paradigm genom att erbjuda en metod för att stärka utvecklingsmässiga mutant analyser samt öka bakgrunden homogenitet.
Detta protokoll kräver omfattande genotypning, så det är viktigt att utveckla en tillförlitlig, snabb genotypning protokoll i förväg. Det finns många genotypning protokoll tillgängliga10,11, men vi hitta KASP genotypning12,13,14 är snabbare, mer kostnadseffektiv, och mer tillförlitlig än metoder baserat på restriktionsenzym klyvning av förstärkta sekvenser10. Därför inkluderar vi ett KASP protokoll i detta arbete. Dessutom, vi fokuserar på skelettet mutant fenotyper i detta protokoll och omfattar ett förfarande för Alcian Blue/Alizarin Red färgning modifierad från tidigare protokoll15.
Den metod som beskrivs här är en enkel strategi för skiftande dödligt mutanta penetrans uppåt eller nedåt. Medan detta protokoll fokuserar på skelettet mutant fenotyper, tror vi att det kommer att vara en användbar strategi för djurhållning av alla muterade zebrafiskar rader. I själva verket nyttan av denna avel strategi sannolikt sträcker sig bortom zebrafiskar. Vi förutspår att detta protokoll kan ändras för att skifta penetrans i ett brett spektrum av organismer. Skiftande dödliga penetrans av avkomman testning kan hjälpa till att driva utvecklingen av eventuella fosterskadande genetiker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiv avel avslöjar subtiliteter genfunktion
Skifta mutant fenotyper för att vara mer eller mindre allvarliga genom selektiv avel är ett enkelt sätt att få nya insikter i geners funktion. Vid jämförelse med standardmetoder för omarkerade avel, kan det protokoll som presenteras här ge en mer fullständig förståelse av muterade fenotyper. Specifikt, genom att generera stammar som är allvarliga, kan hela bredden av muterade fenotyper avslöjas, inklusive några som…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Chuck Kimmel för vägledning, John Dowd för hjälp att utveckla denna avel strategi, Macie Walker för hennes arbete med att finslipa skelett fläcken, och Charline Walker och Bonnie Ullmann för bra zebrafiskar råd. Detta arbete stöds av K99/R00 DE024190 till JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
