Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll å oppdage både senescent og pluripotent stamceller i skjelettmuskulatur på skader, mens inducing i vivo omprogrammering. Denne metoden er egnet for vurdere rollen til mobilnettet senescence under vev gjenfødelse og omprogrammere i vivo.
Abstract
Mobilnettet senescence er en stress reaksjon som er preget av en stabil mobilnettet vekst arrestasjon, noe som er viktig for mange fysiologiske og patologiske prosesser som kreft og aldring. Nylig har senescence også vært involvert i reparasjon av vev og gjenfødelse. Derfor har det blitt stadig mer kritisk til å identifisere senescent celler i vivo. Senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-Gal) analysen er den mest brukte analysen å oppdage senescent celler både kultur og i vivo. Denne analysen er basert på økt lysosomale innholdet i senescent celler, som gjør det histochemical påvisning av lysosomale β-galactosidase aktivitet ved suboptimum pH (6-5.5). Sammenlignet med andre analyser, som flowcytometri, dette gjør identifikasjon av senescent celler i deres bosatt miljø, som gir verdifull informasjon som hvor knyttet til vev arkitektur, morfologi, og muligheten for kopling med andre indikatorer via immunohistochemistry (IHC). Stor begrensning av SA-β-Gal analysen er behovet av friske eller frosne prøvene.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å forstå hvordan mobil senescence fremmer mobilnettet plastisitet og vev gjenfødelse i vivo. Vi bruker SA-β-Gal for å oppdage senescent celler i skjelettmuskulatur ved skade, som er en godt etablert system å studere vev gjenfødelse. Dessuten, vi bruker IHC for å oppdage Nanog, en markør av pluripotent stilk celler, i en transgene musemodell. Denne protokollen kan vi undersøke og kvantifisere mobilnettet senescence i forbindelse med indusert mobilnettet plastisitet og i vivo omprogrammering.
Introduction
Mobilnettet senescence er en form for stressrespons preget av en stabil celle syklus arrestasjon. I det siste tiåret, har forskning fast etablert at senescence er forbundet med ulike biologiske og patologiske prosesser inkludert embryonale utvikling og fibrose organisme aldring1,2. Mobilnettet senescence ble først identifisert i menneskelig fibroblaster på slutten av levetiden replicative utløst av telomere forkortelse3. Foruten replicative stress er det mange andre stimuli som kan indusere senescence, inkludert DNA skade, oksidativt stress, kreftfremkallende signaler og genomisk/epigenomic endringer, som kan til slutt aktivere p53/p21 og/eller pRB veier å etablere og forsterke den permanente vekst arrestasjon1. En viktig kjennetegner senescent celler er at de forblir metabolically aktiv og robust express en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP): utskillelsen av mange inflammatoriske cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulær matrix faktorer4. SASP faktorer er foreslått å spille en viktig rolle i formidling og forsterke senescence effekten, på grunn av sin potente effekt på tiltrekke immunceller og endre lokale og systemisk vev miljøer1. Interessant, har senescence nylig blitt foreslått å være viktig i vev reparasjon og regeneration5,6. I tillegg har data fra flere labs, inkludert vår, foreslått at vev skade-indusert senescence kan forbedre cellulære plastisitet, via SASPs, å fremme regenerering7–9. Derfor markere alle nye data betydningen av å studere senescence i vivo.
I innlegget indusert pluripotent stamceller (iPSC) era er mobilnettet plastisitet kapasiteten i en celle til å anskaffe en ny identitet og vedta en alternativ skjebne når utsatt for ulike stimuli både i kultur og i vivo10. Det er kjent at full omprogrammering kan oppnås i vivo11,12, der uttrykket av den kassetten som inneholder fire Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4og c-Myc (OSKM) kan være indusert i vivo å fremme teratomer formasjon i flere organer. Derfor kan kan programmeres om musemodell (i4F) brukes som et kraftig system for å identifisere kritiske regulatorer og veier som er viktige for mobilnettet plastisitet11.
En egnet og følsom i vivo system er viktig å forstå hvordan mobil senescence regulerer mobilnettet plastisitet i sammenheng med vev gjenfødelse. Her presenterer vi et robust system og en detaljert protokoll å vurdere sammenhengen mellom senescence og mobilnettet plastisitet i sammenheng med vev gjenfødelse. Kombinasjonen av cardiotoxin (CTX) indusert muskel skaden Tibialis fremre (TA) muskelgruppe, en godt etablert system vev gjenfødelse, og i4F musemodell, gjør påvisning av både mobilnettet senescence og i vivo omprogrammere under muskulære.
For å vurdere sammenhengen mellom mobilnettet plastisitet og senescence, er i4F mus skadet med CTX å indusere akutt muskel skader og behandlet med doxycycline (0,2 mg/mL) over 7 dager å indusere i vivo omprogrammering. Mens en CTX indusert akutt muskel skader og gjenfødelse-protokollen er nylig publisert13, etiske grunner, blir denne prosedyren utelatt i gjeldende protokollen. TA muskel prøver hentes på 10 dager innlegg skade13, når toppen av senescent celler er tidligere observert14. Her beskriver denne detaljerte protokollen alle trinnene som er nødvendig å vurdere nivået på senescence (via SA-β-Gal) og reprogramming (via IHC farging av Nanog).
Senescence-assosiert beta-galactosidase (SA-β-Gal) analysen er den mest brukte analysen å oppdage senescent celler både i kultur og i vivo15. Sammenlignet med andre analyser, kan SA-β-Gal analysen identifikasjon av senescent celler i deres eget miljø med intakt vev arkitektur, som er spesielt viktig for i vivo studie. Videre er det mulig å par SA-β-Gal analysen med andre markører bruker IHC. Imidlertid krever SA-β-Gal analysen friske eller frosne prøvene, som fortsatt er en stor begrensning. Når friske eller frosne vev er rutinemessig tilgjengelig, som frosne TA muskel prøver, er SA-β-Gal åpenbart egnede analysen å oppdage senescent celler. Nanog er den brukes til å oppdage reprogramed celler av to grunner: 1) det er en viktig indikator for pluripotency; 2) enda viktigere, uttrykket er drevet av doxycycline (dox), derfor oppdager indusert pluripotency i stedet for tvungen uttrykk for Yamanaka kassetten.
Det er viktig å merke seg flekker protokollene i denne studien kan utføres separat for å forenkle kvantifisering prosedyren, men kan også gjøres i en co flekker prosedyre for å visualisere både senescent og pluripotent stamceller i samme inndeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en metode å oppdage både senescent og pluripotent stamceller i skjelettmuskulatur kan programmeres om mus. Denne metoden kan brukes til å evaluere og kvantifisere både senescence og indusere mobilnettet plastisitet i vivo, og undersøke rollen av senescence i reparasjon av vev og gjenfødelse.
I gjeldende protokollen brukes senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-Gal) analysen til å oppdage i vivo senescent celler i skjelettmuskelen. Denne analyse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er gjeld til Clemire Cimper for hennes utmerket kundestøtte. Arbeid i laboratorium for H.L. ble finansiert av Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche vitenskapelig, og Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’Excellence Revive, Investissement d’Avenir; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) og Fondation ARC (Pja jeg 20161205028). C.C. og AC er finansiert av doktorgrad og postdoktor stipend fra gjenopplive konsortiet.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
