Hier presenteren we een methode voor het meten van direct transfer-RNA opladen niveaus van gezuiverde Escherichia coli RNA als een manier om te vergelijken van de relatieve niveaus van transfer-RNA, of elke andere korte RNA, over verschillende steekproeven gebaseerd op de toevoeging van spike-in cellen die een referentie-gen uitdrukt.
Transfer-RNA (tRNA) is een essentieel onderdeel van de vertalende machine in een organisme. tRNAs binden en overbrengen van aminozuren naar het ribosoom vertalen. Het relatieve niveau van verschillende tRNAs, en de verhouding van aminoacylated tRNA aan totale tRNA, bekend als het opladen niveau, zijn belangrijke factoren bij het bepalen van de nauwkeurigheid en snelheid van de vertaling. Dus, de overvloed en opladen niveaus van tRNAs zijn belangrijke variabelen te meten bij de studie van de eiwitsynthese, bijvoorbeeld onder verschillende omstandigheden van stress. Hier beschrijven we een methode voor het verzamelen van tRNA en direct meten van zowel de relatieve overvloed en het absolute opladen niveau specifieke tRNA soorten in Escherichia coli. Het tRNA wordt geoogst op een zodanige wijze dat de labiele band tussen het tRNA en haar aminozuur behouden blijft. RNA is vervolgens onderworpen aan de Elektroforese van het gel en de noordelijke bevlekken, wat resulteert in de scheiding van de geladen en ongeladen tRNAs. De niveaus van specifieke tRNAs in verschillende monsters kunnen worden vergeleken als gevolg van de toevoeging van spike-cellen voor normalisatie. Voorafgaand aan de zuivering van het RNA voegen we 5% van de cellen van E. coli die hen van de zeldzame tRNAselC aan elk monster. Het bedrag van het tRNA-soorten van belang in een monster is dan op de hoeveelheid tRNAselC in hetzelfde monster genormaliseerd. Toevoeging van spike-cellen vóór RNA zuivering heeft het voordeel ten opzichte van de toevoeging van gezuiverde spike-in RNAs die het ook goed is voor eventuele verschillen in cellysis efficiëntie tussen de monsters.
In de volgende, presenteren we een methode voor het kwantificeren van de specifieke tRNAs en meten hun opladen niveaus door het noordelijke bevlekken. De methode is gebaseerd op een techniek die het eerst ontwikkeld door Varshney et al. 1. door het oogsten van cellen in Trichloorazijnzuur (TCA) en het houden van de monsters bij 0 ° C gedurende de RNA-zuivering, is de ester-binding tussen het tRNA en het aminozuur geconserveerde2,3,4. Aminoacylated tRNAs kunnen worden onderscheiden van hun nonacylated tegenhangers door elektroforese van het gel en het noordelijke bevlekken, zijner tijd voor een verminderde mobiliteit van de aminoacylated in de gel, veroorzaakt door de covalent gebonden aminozuur5tRNA. Daarnaast presenteren we een protocol voor het normaliseren van tRNA hoeveelheden door toevoeging van spike-cellen de zelden gebruikte tRNAselC 4overexpressing.
tRNAs zijn enkele van de meest voorkomende moleculen in de bacteriële cel en een absoluut noodzakelijk onderdeel van de machine vertaling. tRNAs binden van aminozuren en deze overbrengen naar de vertalen ribosomen. De binding van aminozuren te tRNAs (aminoacylation of opladen) wordt vergemakkelijkt door het aminoacyl-tRNA-synthetases. De relatieve overvloed van verschillende geladen tRNAs is belangrijk om te zorgen voor de trouw van de eiwitsynthese, omdat ondervertegenwoordiging van de cognate betalen dat tRNA voor een bepaalde boodschapper-RNA (mRNA) codon verhoogt de waarschijnlijkheid dat een in de buurt van-cognate tRNA zal ten onrechte haar aminozuur aan de groeiende polypeptide-keten op het ribosoom6leveren. Het belang van geladen tRNA wordt weerspiegeld in de uitgebreide reactie van de E. coli cel tot een ernstige daling in de laden niveaus van een tRNA; de strenge reactie. Tijdens de strenge reactie is de synthese van tRNAs, ribosomaal RNAs en meeste mRNAs verlaagd ten gunste van de transcriptie van specifieke mRNAs aminozuur biosynthese en stress survival is gekoppeld en het groeitempo op jaarbasis van de cellen wordt drastisch verlaagd7 . Bovendien heeft recent werk van ons en anderen aangetoond dat E. coli actief de meerderheid van haar tRNA in reactie op benadrukt dat beperken vertaling4,8 degradeert, suggereren dat aanpassing van het tRNA niveaus mogelijk belangrijk voor het omgaan met dergelijke benadrukt. Betrouwbare metingen van tRNA abundanties en opladen niveaus zullen dus een belangrijk instrument voor het volledig begrijpen van bacteriële stress reacties.
E.coli wordt vaak gebruikt om uit te drukken van recombinante eiwitten en vanwege de verschillen tussen soorten in het codon gebruik, suboptimaal expressie is een probleem dat vaak geconfronteerd9. Dit kan worden omzeild door expressie van extra tRNAs nodig om te vertalen van de recombinante mRNA10. Metingen van tRNA opladen niveaus in dergelijke spanningen kunnen begeleiden probleemoplossing inspanningen en optimaliseren van eiwit expressie.
Deze methode maakt het ook mogelijk de detectie van “mischarging”; een tRNA molecuul aminoacylated met een niet-cognate aminozuur. Aminoacylation door verschillende aminozuren kan veroorzaken een tRNA migreren met lichtjes verschillende snelheden t/m polyacrylamide gels1,11. In sommige gevallen kan de methode ook worden gebruikt om te onderscheiden van andere wijziging patronen op identieke tRNAs3.
Andere vastgesteld biochemische procedure voor het onderzoek van tRNA opladen niveaus oxidatie is Perjodaat. De methode is gebaseerd op de observatie dat aminoacylated tRNA is beschermd tegen Perjodaat oxidatie en ongeladen tRNA niet. Na Perjodaat oxidatie behandeling het opladen van het tRNA wordt gebruikt voor het schatten van het opladen niveaus van de geoogste RNA. Echter, het opladen van verschillende tRNAs is aangetoond te worden beïnvloed door de behandeling waardoor sommige onnauwkeurigheid12. De methode gepresenteerde maatregelen opladen rechtstreeks uit gezuiverde RNA, dus exclusief eventuele vooroordelen van chemische of enzymatische reacties. Een beperking van deze methode is dat slechts één soort tRNA wordt ontdekt tegelijkertijd, zodat hoewel het dezelfde Noord vlek kan worden gestript en reprobed voor meerdere tRNAs, is het tijdrovend en enigszins moeizaam gegevens te verzamelen over de vele tRNAs.
Een betrouwbare manier van normaliseren monsters aan elkaar is van vitaal belang in studies waar het doel is om het relatieve niveau van een molecule van verschillende monsters met elkaar vergelijken. Hier introduceren we een normalisatie-procedure voor RNA waar een kleine hoeveelheid van E. coli cellen overexpressing de zeldzame tRNAselC wordt toegevoegd als een piek aan alle experimentele monsters vóór RNA zuivering. Deze methode is nuttig niet alleen bij de behandeling van tRNAs, maar voor relatieve kwantificering van elke soort van RNA wanneer de experimentele opzet is zodanig dat geen endogene RNA kan worden vertrouwd te presenteren in de dezelfde cellulaire concentraties in alle monsters. Bijvoorbeeld, wordt het niveau van een “schoonmaak” RNA-achtige ribosomaal RNA vaak gebruikt als een endogene verwijzing naar het vergelijken van de relatieve hoeveelheden van een andere RNA tussen verschillende monsters13. Maar dit is van weinig nut als de cellulaire concentratie van de referentie-RNA tussen de monsters varieert, zoals het geval voor ribosomaal RNA zijn kan als de bemonstering plaatsvindt tijdens een stress reactie15,16,17 of inwerkingtreding van de stationaire fase17. De toevoeging van spike-cellen aan de experimentele monsters vóór RNA zuivering biedt een solide en nauwkeurige manier van normalisatie onafhankelijk is van de bemonstering setup. Een andere manier van normalisatie is de toevoeging van een of meer spike-in RNAs aan de experimentele monsters na zuivering van RNA. Echter, houdt deze methode geen rekening met eventuele verschillen in RNA herstel tussen de monsters.
Cuvetten van E. coli die overexpress de verwijzing RNA als spike-cellen (Zie Figuur 1) in een experiment met E. coli heeft het nadeel dat het resultaten bovendien van een kleine hoeveelheid exogene E. coli total RNA aan de monsters. We corrigeren voor deze toevoeging door het analyseren van een steekproef met alleen spike-in cellen parallel met de experimentele monsters (Zie de noordelijke vlek in Figuur 2, lane met het label “selC”). Het protocol gepresenteerd is ontwikkeld voor E. coli K-12 maar dreigt te worden die van toepassing zijn voor de meeste bacteriesoorten.
Dit protocol wordt beschreven hoe u tegelijkertijd het te meten opladen van specifieke E. coli tRNAs en het relatieve niveau van de tRNAs in verschillende steekproeven te vergelijken. De kritieke punten van het protocol zijn 1) om de monsters op zodanige wijze dat de cellulaire tRNA opladen niveaus worden bewaard, 2) om te normaliseren tRNA hoeveelheden op zodanige wijze dat relatieve tRNA niveaus in verschillende monsters op betrouwbare wijze kunnen worden vergeleken, en 3) om de sp ecificity van de geselecteer…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken Marit Warrer voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek | Natuurwetenschappen [1323-00343B] en de Deense nationale Research Foundation [DNRF120].
Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
Phenol | Merck | 108-95-2 | |
IPTG | |||
Glucose | |||
Sodium Acetate | |||
EDTA | |||
Ethanol | |||
Tris | |||
Hydrochloric acid | |||
Sodium Chloride | |||
NaH2PO4 | |||
Sodium Citrate | |||
SDS | |||
Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
BSA | |||
Polivinylpyrrolidone | |||
Ficoll | |||
P32 γATP | Perkin Elmer | ||
DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
Crosslinker | |||
Electroblotter | BIO-RAD | ||
Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
Spectrophotometer | |||
Hydridization oven | |||
Geiger-Müller tube | |||
Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
Hybridization tube | |||
Culture Flasks | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
20 ml centrifuge tubes | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
ImageQuant | GE Healthcare | ||
Excel | Microsoft |