Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA’ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.
Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA’lar ek avantajı vardır.
Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C’de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.
tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA’ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA’lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.
E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.
Bu yöntem, aynı zamanda “mischarging”; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA’ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.
Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA’ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA’ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir “temizlik” RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA’ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.
E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane “selC” etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.
Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmakt…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.
Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
Phenol | Merck | 108-95-2 | |
IPTG | |||
Glucose | |||
Sodium Acetate | |||
EDTA | |||
Ethanol | |||
Tris | |||
Hydrochloric acid | |||
Sodium Chloride | |||
NaH2PO4 | |||
Sodium Citrate | |||
SDS | |||
Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
BSA | |||
Polivinylpyrrolidone | |||
Ficoll | |||
P32 γATP | Perkin Elmer | ||
DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
Crosslinker | |||
Electroblotter | BIO-RAD | ||
Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
Spectrophotometer | |||
Hydridization oven | |||
Geiger-Müller tube | |||
Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
Hybridization tube | |||
Culture Flasks | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
20 ml centrifuge tubes | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
ImageQuant | GE Healthcare | ||
Excel | Microsoft |