JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Génétique

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

والهدف من هذا البروتوكول لوصف كيفية استخدام الليزر ميكرويرادييشن لحمل أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك فواصل حبلا بسيطة نسبيا والأضرار معقدة، لدراسة الحمض النووي الضرر إشارات وإصلاح عامل الجمعية في مواقع الضرر الحية .

Abstract

أضرار الحمض النووي يستحث ردود الإشارات وإصلاح محددة في الخلية، هو أمر حاسم لحماية سلامة الجينوم. ميكرويرادييشن الليزر أصبح أداة تجريبية قيمة للتحقيق الحمض النووي الضرر (DDR) وردا في فيفو. ويتيح تحليل خلية واحدة عالية الدقة في الوقت الحقيقي لديناميات الجزيئات في استجابة للأضرار التي يسببها الليزر تنحصر في منطقة سوبميكروميتير في نواة الخلية. ومع ذلك، استخدمت شروط مختلفة بالليزر دون تقدير للاختلافات في أنواع الأضرار التي يسببها. نتيجة لذلك طبيعة الأضرار التي كثيرا ما لا تكون كذلك تتميز أو يسيطر عليها، يسبب التضارب الواضح في التوظيف أو تعديل التشكيلات الجانبية. أظهرنا أن تشعيع مختلف الظروف (أي، أطوال موجية مختلفة، فضلا عن مختلف القوى الإدخال (إيراديانسيس) ليزر femtosecond (خ) القريبة من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)) الناجم عن التجميعات البروتين التسريح وإعادة الإدماج وإصلاح متميزة. وهذا يعكس نوع تلف الحمض النووي المنتجة. هذا البروتوكول ويصف كيف يسمح المعايرة لليزر مدخلات الطاقة التعريفي لكميات مختلفة وتعقيدات الأضرار الحمض النووي، والتي يمكن رصدها بسهولة بالكشف عن الأضرار قاعدة وكروسلينكينج، بولي التفاضلية (ADP-ريبوز) (PAR) الإشارات، و الإصلاح الخاصة بمسار الجمعيات عاملاً في مواقع الضرر. حالما يتم تحديد شروط الضرر، فمن الممكن للتحقيق في آثار تعقيد أضرار مختلفة ويشير إلى الأضرار التفاضلية وكذلك نضوب المنبع factor(s) على أي عامل للفائدة.

Introduction

في فيفو مما يشير إلى تلف الحمض النووي هي “ليست مفهومة جيدا”
في فيفو، الحمض الرصاصية مع هيستونيس وغيرها من العوامل إلى ألياف الكروماتين النموذج. تنظيم هيكل الكروماتين من الأهمية بالنسبة استقلاب الحمض النووي. على سبيل المثال، هو البديل هيستون H2AX فوسفوريلاتيد ترنح-توسع الشعريات تحور (ATM) والأخرى مؤنزم حبلا مزدوجة التالية فواصل التعريفي (جهاز تسوية المنازعات)، ومن المهم لتضخيم إشارة تلف جهاز تسوية المنازعات، فضلا عن توفير موقع إرساء للآخر العوامل. ينتشر من اختيار مسار الإشارات وإصلاح الأضرار تظهر خطيرة يمكن أن يتأثر بهيكل الكروماتين المحلية في مواقع الضرر1. عدد من الكروماتين إعادة عرض العوامل ومرافقين هيستون هستون تعديل الإنزيمات يعينون في الواقع إتلاف المواقع وهامة لكفاءة إصلاح الحمض النووي، تسليط الضوء على أهمية تنظيم الكروماتين في التسريح وإعادة الإدماج وإصلاح2 , 3 , 4-وعلاوة على ذلك، لوحظ الأضرار موقع تجميع أو إعادة تموضع في الخميرة و المورفولوجية5،6،،من78، تذكرنا ريلوكاليزاتيون الجيني المكاني في حجرة سوبنوكلير المرتبطة بالجينات البند9،10. أيضا كشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا في الماوس والخلايا البشرية تعبئة المواقع جهاز تسوية المنازعات، والتأثيرات التي إصلاح الإخلاص ومسار اختيار11،12. وهذا يثير احتمال أن التسريح وإعادة الإدماج/إصلاح قد أيضا يكون ارتباطاً وثيقا بالهندسة النووية، ومنظمة الكروماتين مرتبة أعلى، وكروموسوم الديناميات في نواة الخلية. وهكذا، أنها حاسمة لتطوير أساليب عالية الاستبانة دراسة التسريح وإعادة الإدماج، وإصلاح العمليات في سياق البيئة النووية الذاتية في خلية حية من أجل فهم الآثار القصيرة الأجل والطويلة الأجل لتلف الحمض النووي.

الدور الحاسم للإسمية بوليميراز (تسنى) في قياس مدى ونوع الضرر وتنظم الجمعية البروتين في موقع الضرر
PARP1 هو جهاز استشعار نك الحمض النووي سرعة تفعيلها بأضرار الحمض النووي التي تلعب دوراً حاسما في إصلاح الحمض النووي13. PARP1 كان يعتقد أصلاً أن تعمل جنبا إلى جنب مع الأشعة السينية إصلاح عبر تكملة 1 (XRCC1) لتسهيل إصلاح قاعدة الختان (البر)، ولكن الدراسات الحديثة تكشف عن دورها في سائر مسارات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك إصلاح جهاز تسوية المنازعات14. تنشيط PARP1 الاستخدامات نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD+) كركيزة لشرطة أبوظبي-ريبوسيلاتي البروتينات المستهدفة متعددة، بما في ذلك نفسها. هذا الإنزيم وأفراد الأسرة الآخرين اجتذبت قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة حيث ظهرت مثبطات نشطت واعدة العقاقير العلاجية لحالات السرطان. على الرغم من مثبطات نشطت عثر في بادئ الأمر أن تكون فعالة في مورثة سرطان الثدي (بركة)-تحور خلايا سرطان الثدي، وهناك الآن عدد كبير أدلة لما لها من الآثار في مونو-والجمع بين العلاجات جنبا إلى جنب مع الحمض النووي يضر وكلاء/تشعيع ضد طائفة واسعة من أنواع السرطان مع الطفرات التي لا تقتصر على بركا15،16،،من1718،،من1920.

على المستوى الجزيئي، أبدى التنشيط تسنى القيام بأدوار حاسمة في تنظيم هيكل الكروماتين المحلية في مواقع الضرر. التوظيف تعتمد على قدم المساواة للإنزيمات تعديل الكروماتين يسهل إصلاح جهاز تسوية المنازعات وإصلاح ما تمليه اختيارات المسار، مما يشير إلى دور هام السقالات التعديل الاسمية في مواقع الضرر. 13،21،،من2223،24،25،26،27،،من2829، 30،31 أثبتنا استبعاد البروتين p53-ملزمة 1 (53BP1) مؤخرا من أضرار المواقع الاسمية 32، تقديم أي تفسير بديل لتعتمد على 53BP1 هايبراكتيفيشن (اندجوينينج غير المتجانسة نهيج) التي نشطت المانع وتسليط الضوء على أهمية نشطت في جهاز تسوية المنازعات إصلاح مسار اختيار33،34. PARP1 أيضا مباشرة تصليح باريلاتيس ويؤثر على نشاط الحمض النووي متعددة العوامل14.

باستخدام ميكرويرادييشن الليزر كأداة لدراسة التسريح وإعادة الإدماج/إصلاح في فيفو
أولاً وصفت في عام 196935 ميكرويرادييشن الليزر لإنتاج التعديلات الفرعية ميكرون في الكروموسومات الفردية واستعرض بالتفصيل في 198136. منذ عدة عقود في وقت لاحق، ميكرويرادييشن الليزر كان سيظهر للحث على أضرار الحمض النووي في منطقة سوبميكروميتير محددة في نواة الخلية، وقد ثبت أن تقنية قيمة لدراسة التوظيف أو تعديلات للعوامل المختلفة للحمض النووي آفات فيفو 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41-هذا الأسلوب يتيح الكشف عن تلك العوامل التي لا تشكل البؤر التي يسببها الإشعاع متميزة (عريف) في تلف مواقع39،42. من الممكن أيضا لدراسة ديناميات التغيرات الهيكلية الكروماتين في مواقع الأضرار وفي بقية النواة الزمانية المكانية. نحن مقارنة بعناية DDRs الناجمة عن نظم الليزر المختلفة وإدخال القوى لتقييم العلاقة بين نوع الضرر الحمض النووي وميكرويرادييشن الظروف32،،من4344، 45. تكرار أنماط التوظيف المنحرف ل 53BP1 وتيلوميريك عامل ملزم 2 (TRF2) وقد لوحظت في الدراسات أضرار الليزر السابقة، التي وفرت الأساس لقلق متكرر على الطابع “غير الفسيولوجية” للأضرار التي يسببها الليزر46 47، ،،من4849. وجدنا أن هذه التناقضات الواضحة الآن يمكن أن تفسر التي نشطت التفاضلية الإشارات التي مقاييس كمية وتعقيد الأضرار العمدي32. أكدنا أن: 1) الخلايا الليزر-ميكرويرادياتيد (حتى بعد ارتفاع مدخلات الطاقة التشعيع) اعتقل في الطور البيني بطريقة تعتمد على مراقبة نقطة تفتيش أضرار والبقاء (على الأقل ما يصل إلى 48 س)50من32،؛ و 2) إصلاح عامل التوظيف/التعديلات إخلاص الخص تلك التي لوحظت مع المعاملة مع العوامل الضارة الحمض النووي التقليدية وتحريض جهاز تسوية المنازعات قبل39،اندونوكليسيس،من3242، 44،50،،من5152. بشدة دعم هذه النتائج أهمية فسيولوجية دراسة الاستجابات الخلوية الناجمة عن أضرار الليزر.

Protocol

1. إعداد الخلية الأساسية ملاحظة: هذه الخطوة لكشف الفلورة القياسية لتجنيد البروتين الذاتية أو تعديلها، وعلى استخدام خط الخلية ستابلي معربا عن بروتين المؤتلف المعلمة فلوريسسينتلي. على سبيل المثال، دراسة بوتوروستريداكتيلوس (PtK2) الخلايا الظهارية الكلي جرابي ستابلي معربا ?…

Representative Results

باستخدام خلايا PtK2 ستابلي معربا عن اجفب-53BP11220-1711 أو TRF2-يفب، أجريت معايرة مدخلات الطاقة الليزر لتحديد الشرط الأمثل ل التوظيف (الشكل 1) على32. في مواقع عالية المدخلات-السلطة الليزر الضرر، لوحظت تجميع كبيرة من وثيقة البرنامج القطري (crosslinking الضر?…

Discussion

مزايا استخدام الليزر ميكرويرادييشن للتسريح وإعادة الإدماج للبحث:

1-من الممكن للحث على أنواع مختلفة وكميات من الحمض النووي الضرر من فواصل حبلا بسيط إلى مجمع الحمض النووي الضرر، والضرر إصلاح مختلف العوامل في الحمض النووي للكشف عن المواقع بضبط المعلمات إشعاع الليزر. من الممك?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور أكيرا ين في جامعة توهوكو باليابان بلازميد تعبير بروتينات فلورية خضراء-NTH1، والدكتور دينتشي لازيريني إيروس في معهد أبحاث سكريبس، في لاجولا بكاليفورنيا يفب TRF2 واجفب-53BP11220-1711 التعبير والبلازميدات. هذا العمل كان يدعمها مكتب القوات الجوية للبحث العلمي (FA9550-04-1-0101) ومؤسسة وشركة معهد الليزر بيكمان (إلى M.W.B)، وزمالة مؤسسة فورد من الأكاديمية الوطنية للعلوم (B.A.S)، والمجلس جبهة الخلاص الوطني-1615701 والمؤسسة CRR-17-426665 (إلى “ك. ص”.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection
check_url/fr/56213?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image