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Génétique

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Abstract

DNA-Schädigung induziert spezifische Signal- und Reparatur Reaktionen in der Zelle, die entscheidend für den Schutz der Integrität des Genoms ist. Laser Microirradiation wurde eine wertvolle experimentelles Werkzeug, das DNA-Schäden Antwort (DDR) in Vivozu untersuchen. Es ermöglicht hochauflösende einzellige Echtzeitanalyse von makromolekularen Dynamik in Reaktion auf Laser-induzierten Schäden beschränkt sich auf eine Submikrometer-Region im Zellkern. Jedoch wurden verschiedene Laser Bedingungen ohne Anerkennung der Unterschiede in der Art der Schäden induzierte verwendet. Infolgedessen ist die Art des Schadens oft nicht gut gekennzeichnet oder kontrolliert werden, verursacht die scheinbaren Widersprüche in der Einstellung oder Änderung Profile. Wir zeigten, dass verschiedene Bestrahlungsbedingungen (d.h., verschiedene Wellenlängen sowie verschiedene Eingabe Kräfte (Bestrahlungsstärke) eines Femtosekunden (fs) Nah-Infrarot (NIR) Lasers) verschiedene DDR und Reparatur Protein Baugruppen induziert. Dies spiegelt die Art von DNA-Schäden produziert. Dieses Protokoll beschreibt wie Titration der Eingangsleistung Laser ermöglicht Induktion unterschiedliche Mengen und Komplexität von DNA-Schäden, die durch den Nachweis von Base und Vernetzung Schäden, differenzielle Poly (ADP-Ribose) (PAR) Signalisierung, leicht überwacht werden kann und Bahn-spezifische Reparatur Faktor Baugruppen an Schaden Standorten. Nachdem die Schäden Bedingungen ermittelt wurden, ist es möglich, die Auswirkungen der verschiedenen Schäden Komplexität und Differenzial Schaden Signalisierung sowie Erschöpfung der vorgelagerten wird auf jeder Faktor von Interesse zu untersuchen.

Introduction

In Vivo DNA-Schäden-Signalisierung ist nicht gut verstanden
In Vivo, ist DNA komplexiert mit Histone und andere Faktoren in Form Chromatin Fasern. Regulierung der Chromatinstruktur ist von größter Bedeutung für die DNA-Stoffwechsel. Beispielsweise ist die Histon-Variante H2AX phosphoryliert durch Ataxie-Teleangiektasie mutiert (ATM) und anderen Kinasen folgende Doppel-Strang bricht (DSB) Induktion, und ist wichtig für DSB Schaden Signalverstärkung sowie eine Docking-Website für andere Faktoren. Verbreitung von Schäden Signal- und Reparatur Weg Wahl scheinen kritisch von lokalen Chromatinstruktur bei Schäden Seiten1beeinflusst werden. Eine Reihe von Chromatin umgestalten Faktoren, Histon Chaperone und Histon ändern Enzyme sind in der Tat rekrutiert, um Websites zu beschädigen und sind wichtig für effiziente DNA-Reparatur, die Bedeutung der Chromatin-Verordnung in der DDR und Reparatur2 , 3 , 4. Darüber hinaus Schäden Website clustering oder Neupositionierung wurde beobachtet in Hefe und Drosophila5,6,7,8, erinnert an Relokalisierung der gen-Loci in der subnukleare Fach gen Verordnung9,10zugeordnet. Neuere Studien in Maus und menschlichen Zellen gezeigt auch Mobilisierung der DSB-Seiten, welche Einflüsse Treue und Weg Wahl11,12reparieren. Dies wirft die Möglichkeit, dass die DDR/Reparatur auch eng mit nuklearen Architektur, höherer Ordnung Chromatin Organisation und Chromosom Dynamik im Zellkern verbunden werden kann. Daher ist es wichtig, entwickeln hochauflösende Methoden, die DDR zu studieren und Reparaturprozesse in der endogenen nuklearen Umfeld in einer live Zelle um kurz- und langfristigen Folgen von DNA-Schäden zu verstehen.

Entscheidende Rolle der PAR Polymerase (PARP) bei der Messung das Ausmaß und die Art des Schadens und Regulierung Protein Montage am Standort Schaden
PARP1 ist ein DNA-Nick-Sensor schnell aktiviert durch DNA-Schäden, die in DNA Reparatur13eine entscheidende Rolle spielt. PARP1 wurde ursprünglich gedacht, um zusammen mit x-ray reparieren Cross Ergänzung 1 (XRCC1) base Excision Repair (BER) zu erleichtern, aber neuere Studien zeigen seine Rolle in anderen DNA-Reparatur Bahnen, darunter DSB-Reparatur-14. Aktiviert PARP1 Verwendungen Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NAD+) als Substrat zu ADP-Ribosylate mehrere Zielproteine, einschließlich sich selbst. Dieses Enzym und andere Familienmitglieder haben viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, wie PARP-Inhibitoren als viel versprechende Medikamente gegen Krebs entstanden sind. Obwohl PARP-Inhibitoren zunächst fand bei Brustkrebs-Gen (BRCA) wirksam-Brustkrebs-Zellen, mutiert es gibt jetzt eine Fülle von Beweisen für ihre Wirkungen in Mono- und Kombination Therapien zusammen mit DNA Beschädigung Agenten/Bestrahlung gegen ein breites Spektrum an Krebserkrankungen mit Mutationen nicht beschränkt auf BRCA15,16,17,18,19,20.

Auf der molekularen Ebene zeigte PARP Aktivierung spielen wichtige Rollen bei der Organisation der lokalen Chromatinstruktur Standorten Schaden. PAR-abhängigen Rekrutierung von Chromatin Modifikation Enzyme erleichtert die DSB-Reparatur und Diktat reparieren Weg Möglichkeiten, was die wichtige Gerüst Rolle PAR Modifikation an Schaden Standorten. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , wir haben vor kurzem gezeigt, den Ausschluss von p53-bindendes Protein 1 (53BP1) vor Schäden durch PAR 32, bietet eine alternative Erklärung für 53BP1-abhängige Überaktivierung des nicht-homologe Endjoining (Seiten NHEJ) durch PARP-Inhibitor und Hervorhebung der Bedeutung von PARP in DSB reparieren Weg Wahl33,34. PARP1 Faktoren direkt PARylates und wirkt sich auf die Aktivität von mehreren DNA Reparatur auch14.

Mit Laser Microirradiation als Werkzeug zur DDR/Reparatur In Vivo Studie
Laser Microirradiation, Sub-Mikrometer-Änderungen auf den einzelnen Chromosomen zu produzieren wurde zuerst 196935 beschrieben und detailliert in 198136geprüft. Einige Jahrzehnte später, Laser Microirradiation wurde gezeigt, dass DNA-Schäden an einer definierten Submikrometer-Region im Zellkern zu induzieren, und erwies sich als eine wertvolle Technik, Einstellung oder Modifikationen verschiedener Faktoren zu DNA-Läsionen in Vivo zu studieren 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. diese Methode ermöglicht die Erkennung von jene Faktoren, die keine ausgeprägte Bestrahlung-induzierte Brennpunkte (IRIF) bilden, um Schäden Seiten39,42. Es ist auch möglich, die räumlich-zeitliche Dynamik des Chromatin Strukturveränderungen an Schaden Standorten und in den Rest des Kerns zu untersuchen. Wir sorgfältig verglichen die DDRs induziert durch verschiedene Lasersysteme und Befugnisse, die Beziehung zwischen der Art von DNA-Schäden und die Microirradiation Bedingungen32,43,44, zu bewerten 45. Die aberrante Einstellungsmuster der 53BP1 und telomeric wiederholen Bindungsfaktor 2 (TRF2) beobachtet in den vorherigen Laser Schaden Studien, die die Grundlage für die wiederkehrende Sorge um die “physiologisch” Art der Laser-induzierten Schäden46 ,47,48,49. Wir fanden, dass jetzt diese wesentlichen Unterschiede erklärt werden könnte, durch differenzierte PARP Signalisierung, die Menge und Komplexität der induzierten Schäden32Lehren. Wir bestätigen, dass: 1) Laser-Microirradiated Zellen (auch nach hoher Eingangsleistung Bestrahlung) sind in einer Beschädigung Prüfpunkt Kontrolle-abhängigen Weise in Interphase verhaftet und lebensfähig bleiben (mindestens bis zu 48 h)32,50; und 2) Reparatur Faktor Rekrutierung/Modifikationen treu rekapitulieren die Behandlung mit herkömmlichen DNA-schädigenden Agenzien und DSB Induktion von Endonucleases32,39,42, beobachtet 44,50,51,52. Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die physiologische Relevanz Laser Schaden-induzierte zelluläre Reaktionen zu studieren.

Protocol

1. grundlegende Zelle Vorbereitung Hinweis: Dieser Schritt ist für standard Immunfluoreszenz Erkennung des endogenen Protein Einstellung oder Änderung und für die Verwendung einer Zelllinie stabil ein Eindringmittel tagged rekombinantes Protein zum Ausdruck zu bringen. Zum Beispiel studieren Potorustridactylus (PtK2) Beuteltiere Niere Epithelzellen stabil mit dem Ausdruck EGFP-53BP11220-1711 oder TRF2-YFP in unserem früheren verwendet wurden (Abbildun…

Representative Results

Mit PtK2 Zellen EGFP-53BP11220-1711 oder TRF2-YFP stabil zum Ausdruck zu bringen, wurde Laser Eingangsleistung Titration durchgeführt, um die optimale Voraussetzung für ihre Rekrutierung (Abbildung 1)32bestimmen. Bei hohen Input-Power-Laser Schaden die erhebliche Bündelung von CPD (Vernetzung Schäden durch ultraviolette (UV) Schäden in der Regel generiert) sowie GLP-NTH1 DNA-Glycosylase, die speziell der Grundschaden erkennt…

Discussion

Die Vorteile der Verwendung von Laser Microirradiation für die DDR-Forschung sind:

(1) Es ist möglich, verschiedene Arten induzieren Mengen DNA Beschädigung von einfachen Strangbrüche komplexe DNA-Schäden und zur Erkennung verschiedene Reparatur Faktoren bei der DNA-Schäden Websites durch Anpassung der Laser-Bestrahlung-Parameter. Es ist auch möglich, mehrere Male in den gleichen Zellkern schädigen um Trans -Effekte (siehe Abbildung 3) zu bewerten…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Akira Yasui in Tohoku University, Japan für das GFP-NTH1-Expressionsplasmid und Dr. Eros Lazzerini Denchi am Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien für TRF2-YFP und EGFP-53BP11220-1711 Ausdruck Plasmide. Diese Arbeit wurde von der Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) und der Beckman Laser Institute Inc. Foundation (M.W.B), der Ford Foundation Fellowship von der nationalen Akademie der Wissenschaften (für B.A.S) und NSF MCB-1615701 und CRCC unterstützt CRR-17-426665 (zu K. J.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
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Keywords: Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection
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Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
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