JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Génétique

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

Målet med denne protokollen er å beskrive hvordan du bruker laser microirradiation å indusere typer DNA-skader, inkludert relativt enkel strand bryter og komplekse skade, å studere DNA skade signalnettverk og reparasjon faktor montering på skade nettsteder i vivo .

Abstract

DNA skade induserer bestemte signaliserer og reparasjon svar i cellen, som er avgjørende for beskyttelse av genomet integritet. Laser microirradiation ble et verdifullt eksperimentelle verktøy å undersøke de DNA skade response (DDR) i vivo. Den innrømmer sanntid høyoppløselig encellede analyse av macromolecular dynamics svar på laser-indusert skade begrenset til et submicrometer område i cellekjernen. Men har ulike laser forhold vært brukt uten styrking av forskjeller i typer skader forårsaket. Som et resultat, natur skaden er ofte ikke godt preget eller kontrollert, forårsaker inkonsekvens i rekruttering eller endre profiler. Vi har vist at ulike bestråling forhold (dvs., ulike bølgelengder samt forskjellige input krefter (irradiances) av en femtosecond (AS) nær infrarød (NIR) laser) indusert distinkte DDR og reparasjon protein samlinger. Dette gjenspeiler DNA skade produsert. Denne protokollen beskriver hvor titrering av laser input makt innrømmer induksjon av forskjellige beløp og kompleksiteten i DNA skade, som kan lett overvåkes av gjenkjenning av base og crosslinking, differensial poly (ADP-ribose) (PAR) signalnettverk, og Pathway-spesifikke reparasjon faktor samlinger på skade nettsteder. Når skade forholdene er fastsatt, er det mulig å undersøke effekten av ulike skade kompleksitet og differensial skade signalnettverk og uttømming av oppstrøms factor(s) på noen faktor av interesse.

Introduction

I Vivo DNA skade signalnettverk er ikke godt forstått
I vivo, DNA er kompleksbundet med histones og andre faktorer som skjemaet chromatin fiber. Regulering av chromatin struktur er av avgjørende betydning for DNA stoffskiftet. For eksempel er varianten histone H2AX fosforylert ataksi-telangiectasia mutert (ATM) og andre kinaser følgende dobbel-strand bryter (DSB) induksjon, og er viktig for DSB skade signalforsterkning, samt gi et docking-område for andre faktorer. Spredning av skade signalnettverk og reparasjon veien valg synes å være kritisk påvirket av lokale chromatin struktur skade områder1. En rekke chromatin remodeling faktorer, histone chaperones og histone endre enzymer er faktisk rekruttert skader områder og er viktige for effektiv DNA-reparasjon, fremhever betydningen av chromatin i DDR og reparere2 , 3 , 4. videre skade nettstedet klynger eller omplassering ble observert i gjær og drosophila5,6,7,8, minner om relocalization av genet loci i den subnuclear rommet forbundet med gene regulering9,10. Studier i mus og menneskelige celler avslørte også mobilisering av DSB nettsteder, som påvirker reparere gjengivelse og sti valg11,12. Dette øker muligheten for at DDR/reparasjon kan også være nært knyttet til kjernefysiske arkitektur, høyere orden chromatin organisasjon og kromosom dynamikk i cellekjernen. Derfor er det avgjørende å utvikle høy oppløsning metoder å studere DDR og reparasjon prosesser i forbindelse med endogene kjernefysiske miljøet i en levende celle for å forstå kort – og langsiktige konsekvensene av DNA skade.

Kritiske rolle PAR Polymerase (PARP) i måle omfanget og Type skader og regulere Protein montering på webområdet skade
PARP1 er en DNA nick sensor raskt aktiveres av DNA skade som spiller en avgjørende rolle i DNA reparasjon13. PARP1 var opprinnelig tenkt å fungere sammen med X-Ray reparere Cross utfyller 1 (XRCC1) å forenkle base excision reparasjon (BER), men nyere studier avsløre dens rolle i andre DNA reparasjon veier, inkludert DSB reparasjon14. Aktivert PARP1 bruker nikotinamid adenine dinucleotide (NAD+) som et medium til ADP-ribosylate flere mål proteiner, inkludert seg selv. Dette enzymet og andre familiemedlemmer har tiltrukket seg mye oppmerksomhet de siste årene som PARP hemmere har dukket opp som lovende terapeutiske narkotika for kreft. Selv om PARP hemmere ble opprinnelig funnet for å være effektiv i bryst kreft genet (BRCA)-mutert brystkreft celler, er det nå en mengde bevis for deres virkninger i mono- og kombinasjon terapi med DNA skade agenter/bestråling mot et bredt spekter av kreft mutasjoner ikke begrenset til BRCA15,16,17,18,19,20.

På molekylært nivå, ble PARP aktivisering vist å spille viktige roller i å organisere lokale chromatin strukturen på skade nettsteder. PAR-avhengige rekrutteringen av chromatin endring enzymer forenkler DSB reparasjon og dikterer reparere veien valg, tyder viktig stillas rollen PAR modifikasjon på skade nettsteder. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi nylig demonstrert av p53-binding protein 1 (53BP1) fra skade områder av PAR 32, gir en alternativ forklaring på 53BP1-avhengige hyperactivation av ikke-homologe endjoining ( NHEJ) av PARP hemmer og fremhever betydningen av PARP i DSB reparasjon veien valg33,34. PARP1 også faktorer direkte PARylates og påvirker aktiviteten til flere DNA reparasjon14.

Bruke Laser Microirradiation som et verktøy til å studere DDR/reparasjon i Vivo
Laser microirradiation å produsere sub-mikron endringer på individuelle kromosomene ble først beskrevet i 196935 og omtalt i detalj i 198136. Flere tiår senere, laser microirradiation ble vist å indusere DNA skade på en definert submicrometer region i cellekjernen og ble påvist for å være en nyttig teknikk for å studere rekruttering eller modifikasjoner av ulike faktorer DNA lesjoner i vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denne metoden tillater påvisning av de faktorene som ikke utgjør tydelig bestråling-indusert foci (IRIF) på skade områder39,42. Det er også mulig å undersøke spatiotemporal dynamikken i chromatin strukturelle endringer både på skade områder og resten av kjernen. Vi nøye sammenlignet DDRs indusert av ulike laser systemer og krefter til å evaluere forholdet mellom av DNA skade og den microirradiation forhold32,43,44, 45. Avvikende rekruttering mønstre av 53BP1 og telomeric gjenta bindende faktor 2 (TRF2) ble observert i forrige laser skade studiene, som basisen for den regelmessige bekymringen for “ikke-fysiologiske” natur laser-indusert skade46 ,47,48,49. Vi fant at disse tilsynelatende avvik kan nå forklares med differensial PARP signalering som måler mengden og kompleksiteten i indusert skade32. Vi bekreftet at: 1) laser-microirradiated celler (selv etter høy input-power bestråling) er arrestert i interphase på en måte som skader checkpoint kontroll-avhengige og være levedyktig (minst opptil 48 h)32,50. og 2) reparasjon faktor rekruttering/modifikasjoner trofast recapitulate dem observert med behandling med konvensjonelle DNA skade agenter og DSB induksjon av endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Disse resultatene støtter fysiologiske relevansen av studere laser skade-indusert mobilnettet svar.

Protocol

1. grunnleggende celle forberedelse Merk: Dette trinnet er standard immunofluorescence oppdagelsen av endogene protein rekruttering eller modifisering og bruk av en celle linje stabilt uttrykke en fluorescently merket rekombinante proteiner. For eksempel, studere Potorustridactylus (PtK2) pungdyr nyre epitelceller stabilt uttrykke EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP ble brukt i våre tidligere (figur 1)32. I tilfelle fokus …

Representative Results

Bruker PtK2 celler uttrykke stabilt EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP, ble laser inngangseffekt titrering gjennomført for å bestemme optimale tilstanden deres rekruttering (figur 1)32. På høy input-makt laser skade områder, betydelig klynging av CPD (crosslinking skader vanligvis genereres av ultrafiolett (UV) skade) og GFP-NTH1 DNA glycosylase som spesielt gjenkjenner base skade ble observert. I tillegg ble høyere XRCC1 o…

Discussion

Fordelene med å bruke laser microirradiation for DDR forskning er:

1. det er mulig å indusere forskjellige mengder DNA skade fra enkel strand bryter komplekse DNA skade og for å oppdage ulike reparasjon faktorer i DNA skade områder ved å justere laser irradiation parameterne. Det er også mulig å påføre skade flere ganger i samme cellekjernen for å vurdere trans effekter (som i Figur 3).

2. viktigst, kan hendelser som …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Akira Yasui på Tohoku University, Japan for GFP-NTH1 uttrykk plasmider og Dr. Eros Lazzerini Denchi ved Scripps Research Institute, La Jolla i California for TRF2-YFP og EGFP-53BP11220-1711 uttrykk plasmider. Dette arbeidet ble støttet av Air Force Office for forskning (FA9550-04-1-0101) og Beckman Laser Institute Inc. grunnlaget (for M.W.B), Ford Foundation fellesskap fra National Academy of Sciences (til B.A.S.), og NSF kalt MCB-1615701 og CRCC CRR-17-426665 (til K. Y.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection
check_url/fr/56213?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image