Målet med detta protokoll är att beskriva hur man använder laser microirradiation att framkalla olika typer av DNA-skador, inklusive relativt enkla strand raster och komplex skada, att studera DNA skador signalering och reparation faktor församlingen vid skada platser i vivo .
DNA-skada inducerar specifika signalering och reparation reaktioner i cellen, vilket är avgörande för skyddet av genomet integritet. Laser microirradiation blev ett värdefullt experimentella verktyg att undersöka i DNA skador svar (DDR) i vivo. Det tillåter enskild cell-högupplösta realtidsanalys av makromolekylära dynamics svar på laser-inducerad skada begränsas till en submicrometer region i cellkärnan. Dock har olika laser villkor använts utan uppskattning av skillnader i typer av skada inducerad. Som ett resultat, arten av skadan är ofta inte väl karakteriserade eller kontrolleras, orsakar uppenbar inkonsekvenser i rekrytering eller modifiering profiler. Vi visat att olika bestrålningsvillkoren (dvs, olika våglängder samt olika ingående befogenheter (irradiances) av en (fs) nära infrarött (NIR) femtosecondlaser) inducerad distinkta DDR och reparation protein församlingar. Detta återspeglar typ av DNA-skador som produceras. Det här protokollet beskriver hur titrering av laser ineffekt tillåter induktion av olika belopp och komplexiteten i DNA-skador, som enkelt kan övervakas genom påvisande av bas och crosslinking skador, differentiell poly (ADP-ribos) (PAR) signalering, och väg-specifika reparation faktor församlingar på skada platser. När skador villkoren bestäms, är det möjligt att undersöka effekterna av olika skador komplexitet och differentiell skada signalering samt utarmning av uppströms faktorer på någon faktor av intresse.
In Vivo DNA skador signalering är inte förstått
In vivo, DNA är komplex med histoner och andra faktorer till formuläret kromatin fibrer. Reglering av kromatinstruktur är av avgörande betydelse för DNA ämnesomsättning. Till exempel är Histon varianten H2AX fosforyleras av ataxi-telangiektasi muterat (ATM) och andra kinaser följande dubbel-strand breaks (DSB) induktion, och är viktigt för DSB skada signal förstärkning samt att ge en för webbplats för andra faktorer. Fördelningen av skador signalering och reparation väg val verkar påverkas kritiskt av lokala kromatinstruktur på skada platser1. Ett antal kromatin remodeling faktorer, Histon chaperones och Histon ändra enzymer rekryteras verkligen skada platser och är viktiga för effektiv DNA-reparation, belyser betydelsen av kromatin förordning i DDR och reparera2 , 3 , 4. Dessutom skada webbplatsen klustring eller ompositionering observerades i jäst och drosophila5,6,7,8, som påminner om relocalization gen loci i den subnuclear fack associerade med gen förordning9,10. Nyligen genomförda studier i mus och mänskliga celler visade också mobilisering av DSB platser, vilka influenser reparera trohet och väg val11,12. Det väcker möjligheten att DDR och reparera kan även intimt kopplas till nukleära arkitektur, högre ordningens kromatin organisation och kromosom dynamics i cellkärnan. Därför är det avgörande att utveckla högupplösta metoder för att studera DDR och processer i samband med den endogena nukleär miljön i en levande cell reparation för att förstå kort – och långsiktiga konsekvenserna av DNA-skador.
Avgörande roll för PAR-polymeras (PARP) i mäta omfattningen och typen av skada och reglerar Protein montering på webbplatsen skador
PARP1 är en DNA nick sensor snabbt aktiveras av DNA-skador som spelar en avgörande roll i DNA reparation13. PARP1 ursprungligen tänkt att fungera tillsammans med röntgen reparera Cross kompletterar 1 (XRCC1) att underlätta base excision repair (BER), men senare studier avslöja dess roll i andra DNA reparation vägar, däribland DSB reparation14. Aktiverad PARP1 använder nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) som substrat till ADP-ribosylate flera målprotein, inklusive sig själv. Detta enzym och andra familjemedlemmar har uppmärksammats mycket på senare år som PARP-hämmare har uppstått så lovande terapeutiskt läkemedel mot cancer. Även om PARP-hämmare initialt befanns vara effektivt i bröstcancergenen (BRCA)-muterat bröstcancerceller, finns det nu en uppsjö av bevis för deras effekter i mono- och kombination terapi tillsammans med DNA skada agenter/bestrålning mot ett brett spektrum av cancer med mutationer inte begränsat till BRCA15,16,17,18,19,20.
På molekylär nivå visades PARP aktiveringen att spela avgörande roller i att organisera den lokala kromatinstrukturen på skada platser. PAR-beroende rekrytering av kromatin modifiering enzymer underlättar DSB reparation och dikterar reparera väg val, att föreslå viktiga byggnadsställningar roll PAR modifiering vid skada platser. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi nyligen visat uteslutandet av p53-bindande protein 1 (53BP1) från skador platser av PAR 32, att ge en alternativ förklaring för 53BP1-beroende överaktivering av icke-homolog endjoining ( NHEJ) av PARP-hämmare och lyfta fram betydelsen av PARP i DSB reparera väg val33,34. PARP1 också faktorer direkt PARylates och påverkar aktiviteten av flera DNA reparation14.
Använda Laser Microirradiation som ett verktyg för att studera DDR och reparera In Vivo
Laser microirradiation att producera sub micron ändringar på enskilda kromosomer först beskrevs i 196935 och granskas i detalj i 198136. Flera decennier senare, laser microirradiation visades att inducera DNA-skador på en definierad submicrometer region i cellkärnan och visade sig vara en värdefull teknik att studera rekrytering eller ändringar av olika faktorer DNA lesioner i vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denna metod kan upptäcka de faktorer som inte utgör distinkta bestrålning-inducerad foci (IRIF) vid skada platser39,42. Det är också möjligt att undersöka spatiotemporal dynamiken i kromatin strukturella förändringar både på skada platser och i resten av kärnan. Vi jämförde noggrant de Identifieringsdataposter som induceras av olika lasersystem och input befogenheter att utvärdera förhållandet mellan typ av DNA-skador och de microirradiation villkor32,43,44, 45. De avvikande rekrytering mönster av 53BP1 och telomeric upprepa bindande faktor 2 (TRF2) observerades i de tidigare laser skada studier, som utgjorde basen för den återkommande oro för ”icke-fysiologisk” laser-inducerad skada46 ,47,48,49. Vi hittade att dessa uppenbara skillnader nu kunde förklaras av differentiell PARP signalering som mätare mängden och komplexiteten av inducerad skada32. Vi bekräftade att: 1) laser-microirradiated celler (även efter hög input-power bestrålning) grips i interphasen på ett sätt som skador checkpoint kontroll-beroende och förbli lönsamt (åtminstone upp till 48 h)32,50; och 2) reparation faktor rekrytering/ändringar troget sammanfatta dem som observerats med behandling med konventionella DNA skadande agens och DSB induktion av endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Dessa resultat stöder starkt den fysiologiska betydelsen av studera laser skador-inducerad cellulära svar.
Fördelarna med att använda laser microirradiation för DDR forskning är:
1. det är möjligt att framkalla olika typer och mängder av DNA skada från enkla strand raster till komplexa DNA-skador, och för att upptäcka olika reparation faktorer på DNA skada platser genom att justera parametrarna laser irradiation. Det är också möjligt att orsaka skada flera gånger i samma cellkärnan för att utvärdera trans effekter (som i figur 3).
<p clas…The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Akira Yasui vid Tohoku University, Japan för GFP-NTH1 uttryck plasmiden, och Dr Eros Lazzerini Denchi vid Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien för TRF2-YFP och andra-53BP11220-1711 uttryck plasmider. Detta arbete stöds av av Air Force Office för vetenskaplig forskning (FA9550-04-1-0101) och stiftelsen Beckman Laser Institute Inc. (till M.W.B), de Ford Foundation Fellowship från National Academy of Sciences (till B.A.S), och NSF MCB-1615701 och CRCC CRR-17-426665 (till K. Y.).
Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
Heating System | Ibidi | 10918 | |
Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
Thymidine | SIGMA | T9250 | |
serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
Excel | microsoft | spreadsheet program | |
Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |