Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo
Summary
En kombinasjon av avansert optisk teknikker av laserskanning mikroskopi med lang bølgelengde multi Foton fluorescens eksitasjon ble gjennomført for å fange høy oppløsning, tredimensjonale, sanntid bildebehandling for neural crest vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP) sebrafisk embryoer.
Abstract
Medfødt øye og craniofacial anomalier gjenspeiler forstyrrelser i neural toppen, en forbigående befolkningen i vandrende stamceller som gir opphav til mange celletyper i kroppen. Forstå biologi av neural kam er begrenset, gjenspeiler en mangel på genetisk medgjørlig modeller som kan være studert i vivo og i sanntid. Sebrafisk er en særlig viktig utviklingsmessige modellen for å studere vandrende celle populasjoner, som neural toppen. For å undersøke neural crest overføringen i det tredje øyet, ble en kombinasjon av avansert optisk teknikker av laserskanning mikroskopi med lang bølgelengde multi Foton fluorescens eksitasjon implementert for å ta med høy oppløsning, tredimensjonale, sanntid videoer av tredje øyet i transgene sebrafisk embryoer, nemlig vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP), som sox10 og foxd3 har vist mange dyr modeller å regulere tidlig neural crest differensiering og trolig representere markører for neural crest celler. Flere Foton tidsinnstilt bildebehandling ble brukt til å skjelne atferd og vandrende mønstre av to neural crest celle populasjoner bidra til tidlig øye utvikling. Denne protokollen gir informasjon for å generere time-lapse videoer under sebrafisk neural crest overføring, som et eksempel, og kan brukes til ytterligere for å visualisere den tidlige utviklingen av mange strukturer i sebrafisk og andre modellen organismer.
Introduction
Medfødt øyesykdommer kan forårsake barndommen blindhet og er ofte på grunn av unormalt av skallen neural kam. Neural crest celler er forbigående stamceller som oppstår fra medfødte og danne flere vev i kroppen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Neural crest celler, avledet fra prosencephalon og mesencephalon, gi opphav til beina og brusken til midface og frontal regioner, iris, hornhinnen, trabekulært meshwork, og sclera i anterior segment av øyet. 4 , 6 , 7 , 8 Neural crest celler fra rhombencephalon form disse strukturene buer, kjeven og kardiale utløp skrift. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studier har fremhevet bidrag av neural kam å okulær og periocular utvikling, understreker viktigheten av disse cellene i virveldyr øye utvikling. Faktisk avbrudd av neural crest celle migrasjon og differensiering føre til craniofacial og okulær avvik observert i Axenfeld-Rieger syndrom og Peters pluss syndrom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 derfor, en omfattende forståelse av migrasjon, spredning og differensiering av disse neural crest celler vil gi innsikt i kompleksiteten underliggende medfødt øyesykdommer.
Sebrafisk er en effektiv modell organisme for å studere okulær utvikling, strukturer av sebrafisk øyet er lik for pattedyr i papirformat, og mange gener er evolutionarily konservert mellom sebrafisk og pattedyr. 18 , 19 , 20 i tillegg sebrafisk embryoer er gjennomsiktig og oviparous, tilrettelegge visualisering av øye utvikling i sanntid.
Utvide på tidligere publiserte arbeid,6,7,20 vandrende mønster av neural crest celler ble beskrevet ved hjelp av flere Foton fluorescens time-lapse imaging transgene sebrafisk linjene merket med grønne fluorescerende protein (GFP) under transcriptional kontroll av SRY (sex-bestemme region Y)-boks 10 (sox10) eller Forkhead for D3 (foxd3) genet regulatoriske regioner. 21 , 22 , 23 , 24. flere Foton fluorescens tidsinnstilt bildebehandling er en kraftfull teknikk som kombinerer avansert optisk teknikker av laserskanning mikroskopi med lang bølgelengde multi Foton fluorescens eksitasjon å ta høy oppløsning, tredimensjonale bilder av merket med fluorophores. 25 , 26 , 27 bruk av flere Foton laseren har klare fordeler fremfor standard AC confocal mikroskopi, inkludert økt vev gjennomtrengning og nedsatt fluorophore bleking.
Bruker denne metoden, ble to forskjellige populasjoner av neural crest celler i timingen av migrasjon og vandrende veier diskriminert, nemlig foxd3-positive neural crest cellene i periocular mesenchyme og utvikle øye og sox10-positive neural crest i den craniofacial mesenchyme. Med denne metoden er en tilnærming til å visualisere overføringen for okulær og craniofacial neural crest sebrafisk introdusert, gjør det enkelt å observere regulert neural crest overføring i sanntid under utvikling.
Denne protokollen gir informasjon for å generere time-lapse videoer under øyet utviklingen i vs (sox10:EGFP) og vs (foxd3:GFP) transgene sebrafisk, som et eksempel. Denne protokollen kan videre brukes for høy oppløsning, tredimensjonale, sanntids visualisering av utviklingen av alle okulær og craniofacial struktur avledet fra neural crest celler i sebrafisk. Denne metoden kan videre ytterligere brukes for visualisering av utviklingen av andre vev og organer i sebrafisk og andre dyr modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere Foton tidsinnstilt bildebehandling kan i vivo sporing av forbigående og vandrende celle populasjoner. Denne kraftige teknikken kan brukes til å studere embryonale prosesser i sanntid, og studien, resultatene av denne metoden forbedret gjeldende kunnskap om neural crest celle migrasjon og utvikling. Tidligere time-lapse imaging studier vanligvis benytte AC confocal mikroskopi for laserskanning. 29 , 30 , 31 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Thomas Schilling for vennlig gifting vs (sox10:eGFP) fisk og Mary Halloran for vennlige gifting vs(foxd3:GFP) fisken.
Materials
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope – FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein, ., S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
