Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo
Summary
Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.
Abstract
La chimiotaxie est migration le long du gradient chimique spécifique1. Chimiokines sont chimiotactiques cytokines qui favorisent le trafic cellulaire avec spécificité anatomique et temporelle2. La chimiotaxie est une fonction critique des lymphocytes et autres cellules immunitaires pouvant être quantitativement évalués in vitro. Ce manuscrit décrit des méthodes qui permettent l’évaluation de la chimiotaxie, in vitro et in vivo, pour les types de cellules différents y compris les lignées cellulaires et les cellules natives. L’ in vitro, budgétisation axée sur les plaques permet la comparaison de plusieurs conditions simultanément en temps réel et peut être complétée en 1-4 h. essai In vitro avec des conditions peuvent être manipulées pour introduire des agonistes et des antagonistes, comme ainsi que différencier la chimiotaxie des chemokinesis, qui est le mouvement aléatoire. En vivo traite les évaluations, les cellules immunitaires peuvent être étiquetés avec les colorants fluorescents multiples et utilisés pour transfert adoptif. L’étiquetage différentielle des cellules permet aux populations de cellules mixtes destinés à être introduits dans le même animal, ce qui diminue l’écart et réduit le nombre d’animaux requis pour une expérience suffisamment alimentée. Migration dans le tissu lymphoïde se produit dedans aussi peu que 1 h, et plusieurs compartiments tissulaires peuvent être dégustés. Cytométrie en flux après la récolte du tissu permet une analyse rapide et quantitative des schémas migratoires de plusieurs types de cellules.
Introduction
Immunité solide nécessite la coordination temporelle et spatiale complexe d’une multitude de types de cellules afin de répondre de manière appropriée à l’injure, infection et générer autotolérance. Plusieurs dizaines récepteurs de chimiokines et de leurs ligands correspondantes ont été découverts et caractérisé des mécanismes moléculaires par lesquels les cellules spécifiques peuvent être arrangés en un tissu spécifique à un moment précis. Ainsi, étudier le chimiotactisme et la migration est un élément indispensable de la recherche de l’immunologie. En effet, le test décrit dans vitro a récemment été utilisé comme un outil de dépistage pour identifier un cofacteur chimiotactique qui accélère le chimiotactisme des cellules T vers le C-C chimiokines 19 et 213. Le but des méthodes décrites ici sont de permettre une évaluation quantitative du chimiotactisme des cellules immunitaires in vitro et in vivo.
L’essai de chambre de Boyden (migration cellulaire et l’invasion) est une méthode rapide, reproductible et peu coûteuse pour évaluer la migration de cellules4,5. Dans l’essai standard, la chambre supérieure est ensemencée avec des cellules et est séparée par un insert poreux d’une chambre basse, dans laquelle les cellules migrent. Au moment voulu, les cellules qui ont migré vers le dessous de l’insert peuvent être fixe et colorées pour le dosage au microscope photonique. Toutefois, ces mesures restreignent la collecte de données à un seul point de fin, qui s’oppose à une collecte de données dynamique et peuvent exiger optimisation approfondie pour déterminer le point de temps optimal pour l’analyse. Ici, plusieurs adaptations sont décrits qui permettent des mesures en temps réel, quantitatives et multiplexés de chimiotactisme in vitro.
Pour des études in vivo , un point de terminaison fonctionnel est utilisé, à savoir l’accumulation spécifique des cellules dans un compartiment de tissu donné. Cellules donneuses préalablement étiquetées sont introduits dans les animaux receveurs par transfert adoptif. Ces cellules du donneur soient reconnaissables par la suite par cytométrie en flux après la récolte de tissus destinataire. Également présenté est une stratégie co étiquetage qui permet la détermination de la traite des différents types de cellules au sein d’un seul animal receveur. Cette méthode élimine la variation inter animale de l’injection de cellules et représente la variabilité physiologique des animale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantification de la migration des cellules immunitaires peut être accomplie à l’aide de simple et rapide des analyses in vitro et in vivo. Nous démontrons le chimiotactisme in vitro des monocytes humains en réponse à un gradient de MCP-1 et l’augmentation mammaire par le sérum. In vivo, donneur splenocytes murins ont été étiquetés de façon différente et après transfert adoptif, parasitent les animaux receveurs.
En utilisant un lecteur de pl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Bernard L. Schwartz programme pour médecins chercheurs à l’Université Rockefeller, le Fonds de développement thérapeutique Robertson à la Rockefeller University et le centre de Sackler de biomédecine et de la recherche sur la Nutrition à la Université Rockefeller.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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