Митохондриальной Ca2 + сохранение потенциала пробирного и Ca2 +-срабатывает митохондриальной отек Assay

Summary

Этот протокол направлен для описания метода для изучения Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}– срабатывает митохондриальной отек изолированных митохондриях SH-SY5Y клеток, шаг за шагом.

Abstract

Производства АТФ, окислительное фосфорилирование является основной функцией митохондрий. Митохондрий у высших эукариот также участвуют в цитозольной Ca^{2 +} буферизации, и производства АТФ в митохондриальной может быть опосредовано intramitochondrial бесплатно Ca^{2 +} концентрации. CA^{2 +} водоудерживающего потенциала может рассматриваться как митохондрии возможность сохранить кальция в матрице митохондриальной. Накопленные внутриклеточных Ca^{2 +} приводит к проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, назвал открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), что приводит к утечке молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа. CA^{2 +}-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Здесь мы описываем двух анализов для изучения Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях. После определенного количества Ca^{2 +} добавляются все шаги можно завершить за один день и записан Считыватель микропланшетов. Таким образом, эти два простых и эффективных анализов могут быть приняты для оценки Ca^{2 +}-связанных митохондриальной функции.

Introduction

Митохондрии являются основной сотовой органов производить почти 95% АТФ, используемые окислительного фосфорилирования в mammalian клетках. Сообщается, что поглощенных всех концентрации Ca^{2 +} , митохондрии, присутствие ADP и неорганического фосфата может использоваться для фосфорилировать ADP синтеза АТФ¹. Когда концентрация цитозольной Ca^{2 +} идет выше порога, митохондрии можно поглощение Ca^{2 +} быстро и измеряем его медленно. Таким образом функционирования митохондрий может приток увеличение цитозольной Ca^{2 +}. Отношения к участию в окислительного фосфорилирования, митохондриальных Ca^{2 +} также принимают участие в цитозольной кальция сигналов и активировать механизм митохондриальной apoptotic, вызывая открытие mPTP в внутренней митохондриальной ²мембраны. Широко признано, что аномальные повышение внутриклеточной Ca^{2 +} может вызвать митохондриальной массивные отеки, открыв mPTP³. Таким образом, этот протокол призван оценить функцию митохондрий путем определения количественных показателей митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-trigged митохондриальной отек.

CA^{2 +} водоудерживающего потенциала является измерение способности митохондрий цитозольной поглощение кальция. Митохондрий может регулировать кальций зависимых клеточных процессов поглощения кальция в виде неактивных преципитаты и буфере цитозольной свободного кальция. Нарушением Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала происходит в стресс явления, связанные с ограничением энергии и даже нейродегенеративных заболеваний^4,5. Изолированных митохондриях или digitonin-permeabilized клетки могут использоваться для идентификации Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала, и повышенной способностью накапливать Ca^{2 +} , изолированных митохондриях с дополнительная глутамата и малат не осуществляется митохондриальной изоляции процедура⁶. Титруемая количество digitonin должен быть использован для разрушения мембран плазмы из различных типов клеток. Hexapotassium соль Ca^{2 +}-привязка зеленого флуоресцентного красителя, Ca^{2 +}-чувствительных клеток impermeant видимый свет возбудимых индикатор, был широко используется⁷. CA^{2 +}-привязки зеленого флуоресцентного красителя является показателем низкого сродства и используется, чтобы показать, что внутриклеточные бесплатно Ca^{2 +} концентрации продолжать расти в течение длительного (5 мин) стимуляцию⁸. Этот метод был менее чувствительны, чем метод радиоактивных фильтр, но была значительно упрощена. Дополнительные Ca^{2 +} возвышает кальция Зеленая Флуоресценция и Ca^{2 +} поглощение митохондрий возвращает флюоресценция базовой линии. Последовательных добавлений Ca^{2 +} были сделаны до тех пор, пока митохондрии не поглощения extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Считыватель микропланшетов флюоресценции может использоваться непрерывно доклад кальция зеленой флуоресценцией.

После Ca^{2 +} накопления митохондрии деполяризованный, выпущенный Ca^{2 +} в среду и начал набухать. CA^{2 +}-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Электронная микроскопия и уменьшение поглощения света на 540 Нм может использоваться для измерения Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек^10,11. Митохондрии тома можно непосредственно определяется Форвард угол рассеяния света¹², где уменьшение поглощения отражают пассивной отек митохондриальной матрицы.

Здесь, мы иллюстрируем методологии для изучения митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях от SH-SY5Y клеток.

Protocol

1. изоляция митохондрий Примечание: Все решения и оборудование следует охладить до 0 – 4 ° C и хранится на льду. Семя клетки6 SH-SY5Y около 3 x 10 на 10 см клетки культуры блюдо. Культура клетки в высоких глюкозы Дульбекко модифицированная среднего орла с 10% плода бычьим с?…

Representative Results

Представитель результаты Ca2 + водоудерживающего потенциала:Результаты были высказаны как флуоресценции значения. С дополнительные импульсы Ca2 + (200 nmols/мг митохондриальных белок), увеличилось на двойной выше базовой линии с открытием mPTP флуоресценци?…

Discussion

Здесь, мы описали простой и эффективный протокол для митохондриального Ca^{2 +} сохранение потенциала пробирного и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек пробирного.

Для митохондриального изоляции убедитесь, что все материалы и трубы находятся на льду, особенно к…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001