Ca المتقدرية2 + الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca2 +--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف طريقة لفحص Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}–أثارت الخلايا المتقدرية تورم في الميتوكوندريا المعزولة من ش SY5Y خطوة بخطوة.

Abstract

إنتاج ATP من الفسفرة هي المهمة الرئيسية الميتوكوندريا. الميتوكوندريا في حقيقيات النوى أعلى أيضا المشاركة في سيتوسوليك Ca^{2 +} التخزين المؤقت، وإنتاج ATP في الميتوكوندريا يمكن أن توسط إينتراميتوتشوندريال Ca^{2 +} تركيز مجاناً. يمكن اعتبار Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم في مصفوفة المتقدرية. ووصف المتراكمة داخل الخلايا Ca^{2 +} يؤدي إلى نفاذية غشاء الميتوكوندريا الداخلية، افتتاح نفاذية المتقدرية الانتقال المسامية (mPTP)، مما يؤدي إلى تسرب جزيئات مع الجزيئية وزن أقل من 1.5 كاتشين. Ca^{2 +}–تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. هنا، يمكننا وصف فحوصات اثنين لدراسة Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة. بعد كميات معينة من Ca^{2 +} يتم إضافتها، يمكن الانتهاء في يوم واحد جميع الخطوات ومسجل من قبل قارئ ميكروسكوبية. وهكذا، يمكن اعتماد هذه اثنين من فحوصات بسيطة وفعالة لتقييم Ca^{2 +}-المتقدرية المهام ذات الصلة.

Introduction

الميتوكوندريا هي الأجهزة الخلوية الرئيسية لإنتاج ما يقرب من 95 في المائة ATP تستخدمها الفسفرة في خلايا الثدييات. وأفيد أن يلتقيه micromolar تركيز Ca^{2 +} من الميتوكوندريا، ووجود ADP والفوسفات غير العضوية يمكن أن فوسفوريلاتي ADP إلى ATP توليف¹. عندما يذهب تركيز Ca سيتوسوليك^{2 +} عتبة، الميتوكوندريا يمكن امتصاص Ca^{2 +} سرعة وافلوكس ذلك ببطء. وهكذا، يمكن الميتوكوندريا الأداء تدفق زيادة سيتوسوليك Ca^{2 +}. لا صلة لها بالمشاركة في الفسفرة، كاليفورنيا المتقدرية^{2 +} أيضا المشاركة في إشارات الكالسيوم سيتوسوليك وتنشيط إليه apoptotic الميتوكوندريا بحمل فتح مبتب في الداخلية المتقدرية غشاء². وقد اعترف على نطاق واسع أن ارتفاع غير طبيعي في كاليفورنيا داخل الخلية^{2 +} يمكن أن تحدث تورم المتقدرية الضخمة عن طريق فتح مبتب³. وهكذا، وهذا البروتوكول يهدف إلى تقييم الوظيفة المتقدرية بقياس المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية.

Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات هو قياس قدرة الميتوكوندريا على امتصاص الكالسيوم سيتوسوليك. يمكن المخزن المؤقت الكالسيوم الحر سيتوسوليك الميتوكوندريا وتنظيم العمليات الخلوية المعتمدة على الكالسيوم عن طريق امتصاص الكالسيوم في شكل رواسب غير نشط. يحدث البصر Ca^{2 +} القدرة على الاحتفاظ في الإجهاد الظواهر المرتبطة بالحد من الطاقة والأعصاب حتى الأمراض^4،5. الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا بيرميبيليزيد ديجيتونين يمكن استخدامها لتحديد Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة، وقدرة مرتفعة على تراكم Ca^{2 +} من الميتوكوندريا المعزولة مع غلوتامات الإضافي ومآلات لا يتم عزل المتقدرية الداخلي⁶. ينبغي استخدام كمية معاير من ديجيتونين بيرميبيليزي في الأغشية البلازمية من أنواع مختلفة من الخلايا. ملح هيكسابوتاسيوم Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء، Ca^{2 +}-خلية إيمبيرمينت الحساسة تظهر مؤشر الضوء منفعل، كانت تستخدم على نطاق واسع⁷. Ca^{2 +}-ملزمة الخضراء صبغة الفلورسنت هو مؤشر تقارب منخفضة وتستخدم لإظهار أن داخل الخلايا الحرة Ca^{2 +} تركيزات يواصل الارتفاع خلال فترات طويلة (5 دقائق) التحفيز⁸. هذا الأسلوب هو أقل حساسية من تقنية تصفية المشعة ولكن تم تبسيطها إلى حد كبير. Ca إضافية^{2 +} يرفع fluorescence الكالسيوم الأخضر وترجع Ca^{2 +} امتصاص الميتوكوندريا الأسفار لخط الأساس. وقدمت إضافات متتالية من Ca^{2 +} حتى الميتوكوندريا فشل في امتصاص اكستراميتوتشوندريال Ca^{2 + 9}. يمكن استخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار لتقرير الأسفار الكالسيوم الخضراء باستمرار.

بعد Ca^{2 +} تراكم، depolarized الميتوكوندريا، إصدار Ca^{2 +} في المتوسط، وبدأ الإنتفاخ. Ca^{2 +}–تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. المجهر الإلكتروني، والانخفاض في امتصاص الضوء في 540 نانومتر يمكن استخدامها لقياس Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية^10،11. يمكن تحديد حجم الميتوكوندريا مباشرة بواسطة زاوية الأمام تشتت الضوء¹²، حيث تعكس انخفاض امتصاص سلبية تورم المتقدرية المصفوفة.

هنا، نحن توضيح المنهجية لدراسة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا SH-SY5Y.

Protocol

1-عزل الميتوكوندريا ملاحظة: جميع الحلول والمعدات ينبغي أن بريكوليد إلى 0-4 درجة مئوية وأبقى على الجليد. البذور حوالي 3 × 106 ش-SY5Y الخلايا الواحدة 10 سم خلية الثقافة الطبق. تعديل الخلايا الثقافة في دولبيكو الجلوكوز عالية متوسطة النسر مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين (100 U/…

Representative Results

النتائج ممثلة Ca2 + الاحتفاظ بالقدرة على:وأعرب عن النتائج كقيم الأسفار. مع البقول إضافية من Ca2 + (بروتين نمولس/mg 200 mitochondrial) الأسفار زيادة مزدوجة فوق خط الأساس مع افتتاح مبتب. 5 ميكرومترات بونجكريكاتي (BKA)، المانع من Ca2 +-الناجم عن فتح مبتب، أو أتراكتيلوس…

Discussion

هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة التحليل و Ca^{2 +}-أثارت المقايسة تورم المتقدرية.

لعزل المتقدرية، تأكد من أن جميع المواد وأنابيب يتم على الجليد، لا سيما عند المجانسة الخلايا. 0.25% التربسين-يدتا يمكن أن تستخدم أيضا لفصل الخلايا من الط…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001