Mitokondrie Ca2 + fastholdelse kapacitet analysen og Ca2 +-udløst mitokondrier hævelse Assay

Summary

Denne protokol har til formål at beskrive en metode til at undersøge Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet og Ca^{2 +}– udløst mitokondrier hævelse af isolerede mitochondrier af SH-SY5Y celler trin for trin.

Abstract

Produktionen af ATP ved oxidativ fosforylering er den primære funktion af mitokondrier. Mitokondrier i højere eukaryoter også deltage i cytosole Ca^{2 +} buffer, og ATP produktion i mitokondrie kan være medieret af intramitochondrial gratis Ca^{2 +} koncentration. Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet kan betragtes som mitokondrier evne til at bevare calcium i mitokondriets matrix. Akkumulerede intracellulære Ca^{2 +} fører til permeabilitet af den indre mitokondrielle membran kaldes åbningen af mitokondrie permeabilitet overgangen pore (mPTP), hvilket fører til lækage af molekyler med en Molekylær vægt mindre end 1,5 kDa. Ca^{2 +}-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Her beskriver vi to assays for at undersøge Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet og Ca^{2 +}-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier. Efter visse mængder af Ca^{2 +} er tilføjet, kan alle trin udfyldes på én dag og indspillet af en mikrotiterplade læser. Således, disse to enkle og effektive assays kan vedtages for at vurdere Ca^{2 +}-relaterede mitokondriets funktioner.

Introduction

Mitokondrier er de vigtigste cellulære organer til at producere næsten 95% af ATP anvendes i de pattedyrceller ved oxidativ fosforylering. Det forlyder, at den afsondret micromolar koncentration af Ca^{2 +} af mitokondrier, tilstedeværelse af ADP og uorganisk fosfat kan bruges til at phosphorylate ADP at syntese ATP¹. Når koncentrationen af cytosole Ca^{2 +} går over en tærskel, mitokondrier kan optagelsen Ca^{2 +} hurtigt og efflux det langsomt. Således, de fungerende mitokondrier kan tilstrømning af øget cytosole Ca^{2 +}. Irrelevant for deltagelse i oxidativ fosforylering, den mitokondrielle Ca^{2 +} også tage del i de cytosole calciumsignaler og aktivere mitokondriets apoptotiske mekanisme ved at inducere åbningen af mPTP i den indre mitokondrielle membran². Det har været almindeligt anerkendt, at unormale udvidelse af intracellulære Ca^{2 +} kan fremkalde mitokondrie massive hævelse ved at åbne mPTP³. Således, denne protokol har til formål at vurdere den mitokondrielle funktion af kvantificere mitokondrie Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet og Ca^{2 +}-trigget mitokondrier hævelse.

Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet er måling af mitokondrier evne til optagelse cytosole calcium. Mitokondrier kan buffer cytosole gratis calcium og regulere calcium-afhængige cellulære processer af calcium optagelse i form af inaktive bundfald. Nedsat Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet opstår i stress fænomener forbundet med energi begrænsning og endda neurodegenerative sygdomme^4,5. Isolerede mitochondrier eller digitonin-permeabilized celler kan bruges til at identificere Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet, og den forhøjede evne til at akkumulere Ca^{2 +} af isolerede mitochondrier med yderligere glutamat og malat ikke er foretaget af den mitokondrie isolation procedure⁶. En titreret mængden af digitonin bør anvendes til at permeabilize plasma membraner i forskellige celletyper. Hexapotassium salt af Ca^{2 +}-bindende grøn fluorescerende farvestof, en Ca^{2 +}-følsomme celle-impermeant synligt lys-overgearet indikator, har været udbredte⁷. Ca^{2 +}-bindende grøn fluorescerende farvestof er en indikator for lav-affinitet og bruges til at vise, at intracellulære gratis Ca^{2 +} koncentrationer fortsætter med at stige i løbet af langvarig (5 min) stimulering⁸. Denne metode var mindre følsomme end radioaktive filter teknik, men var stærkt forenklet. Den yderligere Ca^{2 +} hæver calcium grønne fluorescens og Ca^{2 +} optagelse af mitokondrier returnerer fluorescens grundlinjen. Sekventiel tilføjelser af Ca^{2 +} blev foretaget indtil mitokondrier undladt at optagelsen extramitochondrial Ca^{2 + 9}. En fluorescens mikrotiterplade læser kan bruges til løbende rapportere calcium grønne fluorescens.

Efter Ca^{2 +} akkumulering, mitokondrier depolariseret, udgivet Ca^{2 +} til mediet, og begyndte at svulme. Ca^{2 +}-udløst mitokondrier hævelse bruges til at angive mPTP åbning. Elektronmikroskopi og faldet i lys absorbans ved 540 nm kan bruges til at måle Ca^{2 +}-udløst mitokondrier hævelse^10,11. Mitokondrier volumen kan bestemmes direkte ved fremadrettet vinkel lysspredning¹², hvor falder i absorbansen afspejler passiv hævelse af den mitokondriets matrix.

Her viser vi metoden for at undersøge den mitokondrielle Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet og Ca^{2 +}-udløst mitokondrier hævelse i isolerede mitochondrier fra SH-SY5Y celler.

Protocol

1. isolering af mitochondrier Bemærk: Alle løsninger og udstyr bør være forkølede til 0 – 4 ° C og opbevares på is. Frø omkring 3 x 106 SH-SY5Y celler pr. 10 cm celle kultur parabol. Kultur celler i høj-glucose Dulbecco ændrede Eagle medium med 10% føtal bovint serum, penicillin (100 U/mL)-streptomycin (100 µg/mL). Vedligeholde ved 37 ° C i en inkubator indeholdende 5% CO2 natten over.Bemærk: mindst 1-2 x 107 SH-SY5Y celler er nødve…

Representative Results

Repræsentative resultater af Ca2 + fastholdelse kapacitet:Resultaterne blev udtrykt som fluorescens værdier. Med de ekstra pulser af Ca2 + (200 nmols/mg mitokondrie protein), fluorescens steg med dobbelt over baseline med mPTP åbning. 5 μM Bongkrekate (BKA), en hæmmer af Ca2 +-induceret mPTP åbning eller 1 μM atractyloside (ATR), en aktivator af Ca2 +-induceret mPTP åbning, blev tilføjet i isolerede mitochondrier. Mængden …

Discussion

Her, vi beskrevet en enkel og effektiv protokol til mitokondrie Ca^{2 +} fastholdelse kapacitet analysen og Ca^{2 +}-udløst mitokondrier hævelse assay.

Til mitokondrie isolering, Sørg for at alle materialer og rør er på isen, især når homogenisering cellerne. 0,25% trypsin-EDTA kan også bruges til at løsne celler fra fad i 5 min ved 37 ° C. Efter 15-25 slag er det nødvendigt at observere intakt cellemembranen under mikroskop og undgå brud af mitokondrier membran. Me…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001