Mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée gonflement Mitochondrial test

Résumé

Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca^{2 +} et Ca^{2 +}- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.

Résumé

La production d’ATP par phosphorylation oxydative est la principale fonction des mitochondries. Les mitochondries chez les eucaryotes supérieurs participent également à cytosolique Ca^{2 +} mise en mémoire tampon, et la production d’ATP dans les mitochondries peut être véhiculée par intramitochondrial Ca^{2 +} concentration libre. Capacité de ca^{2 +} rétention peut être considérée comme la capacité des mitochondries pour retenir le calcium dans la matrice mitochondriale. Ca intracellulaire accumulé^{2 +} conduit à la perméabilité de la membrane mitochondriale interne, appelé l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP), ce qui conduit à la fuite des molécules avec un moléculaire poids moins de 1,5 kDa. Ca^{2 +}-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. Nous décrivons ici deux essais afin d’examiner la capacité de rétention en Ca^{2 +} et Ca^{2 +}-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées. Après certains montants de Ca^{2 +} sont ajoutés, toutes les étapes peuvent être remplies en une seule journée et enregistrés par un lecteur de microplaques. Ainsi, ces deux tests simples et efficaces peuvent être adoptées pour évaluer le Ca^{2 +}-fonctions mitochondriales liées.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux organes cellulaires pour produire près de 95 % de l’ATP utilisé dans les cellules de mammifère par la phosphorylation oxydative. Il est signalé que la concentration micromolaire séquestrée de Ca^{2 +} par les mitochondries, la présence d’ADP et de phosphate inorganique peut être utilisé pour phosphoryler l’ADP à la synthèse d’ATP¹. Quand la concentration cytosolique Ca^{2 +} va au-delà d’un seuil, les mitochondries peuvent absorption Ca^{2 +} rapidement et l’efflux il lentement. Ainsi, les mitochondries de fonctionnement peuvent afflux l’augmentation Ca cytosolique^{2 +}. San....

Protocole

1. isolation des mitochondries

Remarque : Toutes les solutions et les équipements doivent être prérefroidir 0 - 4 ° C et gardés sur glace.

1. Semences environ 3 x 10⁶ SH-SY5Y cellules / boîte de Petri de cellule 10 cm. Des cellules de culture en haute-glucose Dulbecco modifiée milieu Eagle avec 10 % sérum de veau fœtal, la pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Maintenir à 37 ° C dans un incubateur contenant 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   NOTE : au moins 1-2 x 10⁷ SH-SY5Y cellules sont nécessaires pour chaque dosage d’isolement.
2. Retirez le support et laver les cellules avec enviro....

Résultats

Représentant les résultats de Ca^{2 +} capacité de rétention :
Les résultats ont été exprimés en valeurs de fluorescence. Avec les impulsions supplémentaires du Ca^{2 +} (200 nmols/mg protéine mitochondriale), la fluorescence a augmenté de double au-dessus de référence avec l’ouverture du mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibiteur de Ca^{2 +}-induite par le mPTP ouverture ou 1 μM atractyloside (RTA), un activateur de Ca^{2 +}-induite par le mPT.......

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole simple et efficace pour le mitochondrial Ca^{2 +} rétention capacité dosage et Ca^{2 +}-déclenchée essai de gonflement mitochondrique.

Pour l’isolement mitochondriale, assurez-vous que tous les matériaux et les tubes sont sur la glace, surtout quand les cellules de l’homogénéisation. 0,25 % de trypsine-EDTA peut également servir pour détacher les cellules du plat pendant 5 min à 37 ° C. Après les coups de 15-25, il est nécessaire d’observer l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lignée cellulaire SH-SY5Y	ATCC (The Global Bioresource Center)	Numéro ATCC : CRL-2266
Vert calcique-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-liant vert colorant fluorescent
inhibiteurs complets de protéase	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
homogénéisateur de verre	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
roténone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
à haute teneur en glucose Dulbecco' s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4,5 g/L de glucose, L-glutamine, sans pyruvate
de sodium Sérum fœtal bovin	Hyclone	SV30087
pénicilline	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycine	Invitrogen	11860-038
Kit de dosage BCA	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
Plat de culture cellulaire de 10 cm	NEST	704001