Визуализация и живой изображений Олигодендроциты органелл в Organotypic мозга фрагментов с помощью аденоассоциированный вирус и конфокальная микроскопия
Summary
Олигодендроциты Myelinating способствуют быстрое действие потенциал распространения и выживаемость нейронов. Описанные здесь — это протокол для выражения конкретных Олигодендроциты флуоресцентных белков в organotypic срезы мозга с последующим покадровой изображений. Кроме того представлена простая процедура для визуализации неокрашенных миелина.
Abstract
Нейроны полагаться на электроизоляции и трофические поддержки myelinating олигодендроциты. Несмотря на важность Олигодендроциты дополнительные инструменты в настоящее время используется для изучения нейронов, лишь частично были приняты исследователями олигодендроциты. Ячейка пятнать вирусный трансдукции конкретного типа является полезным подходом для изучения динамики живых органеллы. Этот документ описывает протокол для визуализации Олигодендроциты митохондрий в срезах головного мозга organotypic, трансдукция с аденоассоциированный вирус (AAV) гены для митохондриального целевых флуоресцентных белков под контролем транскрипционный анализ Промоутер основной белок миелина. Она включает в себя протокол для изготовления organotypic корональных мыши мозга ломтиками. Ниже представлена процедура затем time-lapse изображений митохондрий. Эти методы могут быть переданы в другие органеллы и могут быть особенно полезными для изучения органеллы в Миелиновые оболочки. Наконец мы описывают метод легко доступны для визуализации неокрашенных миелина в живых фрагментов, конфокальная отражения микроскопии (ядро). Ядро не требует дополнительного оборудования и может быть полезно для идентификации Миелиновые оболочки во время живых изображений.
Introduction
Белого вещества мозга состоит из аксонов нервных клеток, завернутые в миелина, специализированные расширенной плазматической мембраны, образованный олигодендроциты. Миелина необходима для быстрого и надежного действия потенциал распространения и долгосрочное выживание Миелинизированные аксонов, и потеря миелин может вызвать неврологической дисфункции. Несмотря на их важность свойства Олигодендроциты менее известные сравниваются с нейронов и астроциты. Следовательно меньше инструменты были разработаны для изучения олигодендроциты.
Живут изображений Органеллы клетки, такие как митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ER) или различные везикулярного структуры может быть полезным для изучения динамических изменений в органеллы с течением времени. Традиционно изображения живых Олигодендроциты была выполнена в монокультур1,2. Однако Олигодендроциты в монокультуре не отображаются компактные миелина, и кусочки острый мозга или organotypic таким образом, может быть лучшим вариантом, при изучении движения органелл и локализации. Локализация небольших органеллы и белков в Миелиновые оболочки может быть сложным из-за короткого расстояния между Миелинизированные Аксон и окружающие Миелиновые оболочки. Таким образом только свет микроскопические иммуноокрашивания процедуры не имеют пространственное разрешение для различения органеллы в Миелиновые оболочки и те в Миелинизированные аксон. Это может быть решена путем вирусного трансдукция с генами органеллы целевой флуоресцентных белков, движимый промоутеров определенного типа клеток. Преимущества являются клетки конкретные и разреженные выражение, которое дает возможность точной оценки органеллы локализации и динамики. Трансгенные животные могут также использоваться для достижения таких целевых Органеллы клетки конкретных выражение3. Однако производство и обслуживание трансгенных животных дорого и обычно не предлагают разреженные выражение, которое может быть достигнуто путем вирусных методов.
Метод, описанный здесь использует вирусные трансдукции Олигодендроциты с таргетингом на митохондриальной флуоресцентных белков (dsred или Зеленый флуоресцирующий белок, GFP) обусловлен промоутер основного белка миелина (MBP-mito-dsred или MBP-mito-GFP) для визуализации Олигодендроциты митохондрий в organotypic срезы мозга. Кроме того выражение другого флуоресцирующего белка в цитоплазме (GFP, используемые вместе с mito-dsred или tdtomato, используемые с mito-GFP) используется для визуализации морфологии клеток, включая цитоплазматических отсеков Миелиновые оболочки. Протокол включает в себя процедуры для приготовления organotypic срезы мозга (модифицированная версия протокола, описанный De Simoni и Юй, 20064,5). Мы затем описать покадровой изображений процедуры для изучения митохондриальной движения. Эта процедура использует вертикально Конфокальный микроскоп с непрерывный обмен изображений среднего, установки, что позволяет легко применение наркотиков или других средних изменений во время визуализации. Промежуток времени визуализации процедура может быть выполнена на любой конфокального микроскопа, с некоторым дополнительным оборудованием для поддержания жизни ломтиками, как описано ниже. Протокол также содержит несколько советов для оптимизации изображений и уменьшить Фототоксичность.
И наконец описан простой и быстрый способ визуализировать неокрашенных миелина, конфокальная отражения микроскопии (ядро). Это может быть полезно для идентификации Миелиновые оболочки во время живых изображений. В последние годы несколько методов были разработаны для миелина изображения без каких-либо окрашивание требуется, но большинство из них требуют определенного оборудования и специалистов6,7,8. Процедуру, описанную здесь используется отражательные свойства Миелиновые оболочки и версия упрощенный сингл возбуждения волны спектральных характеристик Confocal микроскопии (оценка, в которых некоторые лазерные длин волн объединяются, чтобы визуализировать миелина) 9. ядро может быть сделано на любой Конфокальный микроскоп имеющий 488 нм лазер и 470-500 Нм полосовой выбросов или выбросов перестраиваемый фильтр.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол для изготовления organotypic культур, в описанный здесь является модифицированной версии18 протокола, описанный De Simoni и ю. (2006)5. Наиболее важные изменения были изложены ниже. Трис-буфер добавляется к питательной среды, которая улучшает выживание ломтики ког…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Bergersen Линда Хильдегард и Magnar Bjørås для доступа к ячейке лаборатории и оборудование, персонал Janelia молекулярной биологии общий ресурс для плазмид и вирусом производства и Koen Vervaeke для помощи с измерения мощности лазера. Эта работа финансировалась ассоциацией норвежской здравоохранения, Норвежский исследовательский совет и микроскопии оборудование было профинансировано Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
References
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
