Nous présentons ici la surveillance en temps réel de la migration cellulaire dans un essai de cicatrisation avec les cellules épithéliales mammaires appauvri TIP60 MCF10A. La mise en œuvre de techniques d’imagerie de cellules vivantes dans notre protocole nous permet d’analyser et de visualiser les unicellulaires mouvement en temps réel et au fil du temps.
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Article de méthode
Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’essai de cicatrisation est efficace et l’un des moyens plus économiques pour l’étude de migration cellulaire in vitro. Classiquement, les images sont prises au début et la fin d’une expérience à l’aide d’un microscope à contraste de phase, et les capacités de migration des cellules sont évaluées par la fermeture des plaies. Cependant, le mouvement cellulaire est un phénomène dynamique, et une méthode conventionnelle ne permet pas pour le suivi de mouvement de cellule unique. Afin d’améliorer les tests de cicatrisation actuellement, nous utilisons les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller la migration cellulaire en temps réel. Cette méthode permet de déterminer le taux de migration cellulaire basé sur une cellule, système de suivi et fournit une meilleure distinction entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire. Ici, nous montrent l’utilisation de l’imagerie de cellules vivantes dans des essais de cicatrisation pour étudier les capacités différentes de migration des cellules épithéliales mammaires, influencées par la présence de TIP60. Motilité cellulaire est très dynamique, notre méthode fournit plus d’idées dans les processus de cicatrisation qu’un instantané de la fermeture de la plaie avec les techniques d’imagerie traditionnels utilisés pour les essais de cicatrisation.
Introduction
VIH-Tat-interactive protéine de 60 kDa (TIP60) est une acétyltransférase de lysine qui peut acetylate histone et protéines non histones1,2. Ses fonctions sont trouvent à avoir des incidences sur les multiples voies de signalisation, y compris la transcription, la réparation de lésions de l’ADN et apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. en outre, TIP60 est souvent diminuée dans les cancers et sa....
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Protocole
1. préparation
- Préparer le milieu de culture MCF10A : moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) avec 5 % de cheval sérum, 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, 100 ng/mL de toxine de choléra et 10 µg/mL d’insuline.
- Préparer un milieu sans sérum : DMEM/F12 (1:1) avec 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, la toxine cholérique 100 ng/mL et 10 µg/mL d’insuline.
- Utilisez la séquence de siARN suivants :
siControl :
Avant : 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
Revers : 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
siTIP60 :
Avant : 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
Revers : 5'-UCAUA....
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Résultats
Schéma général du test de Migration cellulaire axée sur l’imagerie de cellules vivantes
Figure 1 a est un schéma du présent protocole. MCF10A cellules transfectées avec siControl a montré une morphologie épithéliale typique. Après l’épuisement des TIP60, MCF10A cellules étaient plus mésenchymateuses par rapport aux cellules témoins (Figure 1 b).
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Discussion
On sait que dans le processus de migration cellulaire, les cellules peuvent soit déplacer sous forme de feuilles adhérentes ; des grappes ; ou seul, isolés des cellules. Le mode et la dynamique de l’invasion des cellules peuvent varier d’une affection à l’autre, et le phénotype peut changer en quelques heures. L’analyse de cicatrisation traditionnelle est basée sur snapshot images tirées d’un microscope avec un intervalle de temps, par exemple 12 ou 24 h. Il est donc difficile de saisir la dynamique de la fermeture de la.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Nous remercions les membres du laboratoire JAI pour discussion utile et observations. S.J. a été pris en charge par des subventions de la National Research Foundation Singapour et le Singapour du ministère de l’éducation dans ses centres de recherche de l’initiative d’Excellence pour le Cancer Science Institute de Singapour (R-713-006-014-271), le National Medical Conseil de la recherche (CBRG-NIG ; BNIG11nov001 et CS-IRG ; R-713-000-162-511), le Fonds de recherche universitaire du ministère de l’éducation (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. et C.Y.T. ont été pris en charge par une bourse d’études supérieures décernée par l’Institut de Science Cancer de Si....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cellule MCF10A | ATCC | CRL-10317TM | Cellule épithéliale mammaire |
| Milieu DMEM/F12 (1:1) | Gibco | 11330-032 | Milieu de culture MCF10A |
| Facteur de croissance épithéliale (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Suppléments pour milieux de culture MCF10A |
| Toxine cholérique | Sigma-Aldrich | C-8052 | Suppléments pour milieux |
| de culture MCF10AHydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Suppléments pour milieux de culture MCF10A |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I-1882 | Suppléments pour milieux de culture MCF10A |
| Sérum domestique | Gibco | 16050-122 | Suppléments pour milieux de culture MCF10A |
| Trypsine | Gibco | 25200-056 | Pour MCF10A Détacher de la plaque |
| Hémacytomètre | Fisher Scientific | 267110 | Pour le comptage des cellules |
| Opti-MEM milieu sérique réduit | Gibco | 31985-070 | Pour mélange de siRNA |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Réactif transfectif |
| Réactif Trizol | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | Pour l’extraction de l’ARNm |
| Kit de synthèse d’ADNc iScript | Bio-Rad | 170-8891 | Pour l’ADNc génération |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | Pour qPCR en temps réel |
| 7500 Système de PCR rapide en temps réel | Biosystems | Antenne qPCR en temps réel Antenne de | |
| 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | Pour l’expérience Knockdown |
| Plaque à 24 puits | Cellstar | 662160 | Pour le test de cicatrisation des plaies |
| siControl siRNA | Self conçu | Auto-conçu | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | auto-conçu | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT | |
| Observateur de cellules vivantes | Zeiss | Zeiss inversé Observateur de cellules pour des expériences sur cellules vivantes |
Références
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B.
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Réimpressions et autorisations
