Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक murine मॉडल में किसी लक्ष्य कक्ष के vivo antigen-विशिष्ट killing में का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए है ।
Abstract
प्रतिजन-विशिष्ट हत्या के लिए वर्तमान के तरीके में उपयोग या संक्रामक रोग मॉडल में इस्तेमाल किया इन विट्रो तक सीमित हैं । हालांकि, वहां एक प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक संक्रमण के बिना प्रतिजन विशिष्ट हत्या को मापने के लिए इरादा नहीं है । यह प्रोटोकॉल डिज़ाइन किया गया है और सीडी+ टी कोशिकाओं vivo मेंकिसी लक्ष्य कक्ष की antigen-विशिष्ट हत्या का पता लगाने के लिए अनुमति देकर इन सीमाओं को दूर करने के लिए विधियों का वर्णन करता है । यह एक पारंपरिक CFSE के साथ एक टीकाकरण मॉडल विलय द्वारा पूरा किया है, लक्ष्य की हत्या परख लेबल । इस संयोजन की अनुमति देता है शोधकर्ता प्रतिजन-विशिष्ट CTL क्षमता का आकलन करने के लिए सीधे और जल्दी के रूप में परख ट्यूमर विकास या संक्रमण पर निर्भर नहीं है । इसके अलावा, readout प्रवाह cytometry पर आधारित है और इसलिए आसानी से सबसे शोधकर्ताओं के लिए सुलभ होना चाहिए । अध्ययन की प्रमुख सीमा वीवो में समयरेखा की पहचान है जो परिकल्पना के लिए उपयुक्त है परीक्षण किया जा रहा है । प्रतिजन शक्ति और टी कोशिकाओं है कि अंतर cytolytic समारोह में परिणाम हो सकता है में उत्परिवर्तनों में बदलाव के लिए सावधानी से सेल फसल और आकलन के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन की जरूरत है । टीकाकरण के लिए पेप्टाइड की उचित एकाग्रता hgp10025-33 और ओवा257-264के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन अन्य पेप्टाइड्स कि अधिक एक दिया अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है के लिए आगे सत्यापन की जरूरत होगी. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल vivo में हत्या समारोह का एक त्वरित आकलन की अनुमति देता है और किसी भी प्रतिजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
एक सीडी+ या सीडी+ T-सेल की cytolytic (CTL) क्षमता का आकलन करने के लिए एकाधिक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । इस आकलन को आसानी से नियंत्रित शर्तों के तहत इन विट्रो में किया जा सकता है1,2,3. इसके अलावा, संक्रामक रोग मॉडल, जैसे LCMV, प्रतिष्ठित CTL समारोह में विभेदक CFSE (5-(और 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर के उपयोग के माध्यम से जांच की है) लक्ष्य कोशिकाओं लेबल जहां CFSEहाय-लेबल कोशिकाओं रहे है एक पेप्टाइड और CFSElo-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के साथ स्पंदित छोड़ दिया जाता है । कोशिकाओं को तो एक 1:1 अनुपात में इंजेक्शन और CFSEहायके नुकसान के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं, प्रवाह cytometry4द्वारा लेबल स्पंदित लक्ष्य । वैक्सीन और अस्वीकृति मॉडल भी vivo में दोनों सीडी+ और सीडी+ टी कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NK कोशिकाओं5,6द्वारा हत्या के आकलन के लिए इसी तरह की रणनीतियों का इस्तेमाल किया है । यह एक शक्तिशाली परख है, लेकिन संक्रामक एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता है कि प्रधानमंत्री प्रतिरक्षा प्रणाली को लक्ष्य इंजेक्शन से पहले ।
इस प्रोटोकॉल, दूसरी ओर, मेजबान की कोई पूर्व संक्रमण की आवश्यकता है और इसके बजाय प्रधानमंत्री को एक टीकाकरण रणनीति प्रतिरक्षा प्रणाली का इस्तेमाल करने से पहले लक्ष्य इंजेक्शन के लिए । इस टीकाकरण एक पानी पेप्टाइड वैक्सीन का निर्माण आधारित है जो एक immunostimulatory कॉकटेल के प्रावधान की आवश्यकता है शामिल है covax7, एक टोल से मिलकर-रिसेप्टर की तरह 7 (TLR7) एगोनिस्ट (imiquimod क्रीम), एक agonistic विरोधी CD40 एंटीबॉडी, और interleukin-2 (IL-2) पेप्टाइड-विशिष्ट भड़काना और मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संमिश्रण के लिए immunostimulatory एजेंटों के संयोजन synergistic करने के लिए अग्रणी । जैसे, इस परख CTL समारोह के एक त्वरित readout प्रदान करता है के रूप में वैक्सीन केवल तीन दिन के लक्ष्य कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले समारोह के आकलन के लिए कोशिकाओं के साथ प्रशासित है । इसके अलावा, covax भड़काने काफी मजबूत है कि प्रधानमंत्री प्रतिजन विशेष टी सेल की हत्या क्षमता इंजेक्शन के बाद 4 और 24 ज के बीच देखा जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा vivo में लक्ष्य की हत्या का पता लगाने के लिए समयरेखा की पहचान है कि दोनों प्रतिजन और परिकल्पना परीक्षण किया जा रहा है के लिए उपयुक्त है । सावधान आकलन किया जाना चाहिए, प्रतिजन शक्ति में बदलाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक परिवर्तन टी कोशिकाओं में परीक्षण किया जा रहा अंतर CTL समारोह है कि लक्ष्य की हत्या का एक अलग समय का पता लगाने की आवश्यकता होगी में परिणाम सकता है । इसके अलावा, जबकि टीकाकरण के लिए पेप्टाइड की उचित एकाग्रता मानव मेलेनोमा प्रतिजन glycopeptide १०० (hgp10025-33) और ovalbumin257-264 (ओवा257-264)8,9 के लिए अनुकूलित किया गया है , और अधिक किसी दिए गए अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है एक antigen मॉडल का उपयोग आगे मांयता की आवश्यकता होगी । एक लक्ष्य प्रतिजनों की क्षमता में प्रत्याशित मतभेदों के कारण एक सहायक के रूप में covax के साथ संयोजन में CTL प्रभाव समारोह को उत्तेजित करने के लिए, IL-2 खुराक एकाग्रता और खुराक आवृत्ति के अनुकूलन के लिए वांछित लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल vivo में हत्या समारोह के एक त्वरित आकलन के लिए अनुमति देता है और किसी भी प्रतिजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि इस प्रोटोकॉल सीधा है, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सावधानी से किया जाना चाहिए रहे हैं । covax भड़काने antigen-विशिष्ट टी सेल परीक्षण किया जा रहा के निंनलिखित इंजेक्शन स्पंदित लक्ष्यों के किसी भी हत्य?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH रिसर्च (A1R03AI120027 (आरएन) और 1R21AI20012 (आरएन)), संस्थागत अनुसंधान अनुदान (आरएन), स्टार्ट-अप ग्रांट (आरएन), और एमडी एंडरसन सीआईसी सीड ग्रांट (आरएन) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
