Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과
Summary
이 프로토콜의 목표 vivo에서 의 검출에 대 한 항 원 특정 murine 모델에서 목표 셀의 살인을 허용 하는 것입니다.
Abstract
항 원 특정 살인에 대 한 현재 방법은 생체 외에서 사용을 제한 또는 전염병 모델에 활용. 그러나, 감염 없이 항 원 특정 살인을 측정 하기 위한 프로토콜이 아니라 있다. 이 프로토콜은 설계 및 항 원 특정의 검출 함으로써 이러한 한계를 극복 하는 방법을 설명 합니다+ T vivo에서세포 CD8 하 여 목표 셀의 살인. 이 분석 결과 죽이고 전통적인 CFSE 표시 대상 접종 모델을 병합 하 여 수행 됩니다. 이 조합은 분석 결과 감염 또는 종양의 성장에 따라 의존 하지 않습니다 직접 그리고 신속 하 게 항 원 특정 CTL 잠재력을 평가 하는 연구원을 수 있습니다. 또한, 판독 cytometry에 기반 하 고 그래서 대부분 연구자에 게 쉽게 접근할 수 있어야. 연구의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 테스트 중인 가설에 적합 한 식별 됩니다. 항 원 강도 변화와 차동 cytolytic 함수에서 발생할 수 있는 T 세포에 돌연변이 세포 수확 및 평가 대 한 최적의 시간을 결정을 신중 하 게 평가 해야 합니다. 예방 접종에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 맞게 최적화 된 hgp10025-33 , OVA257-264, 하지만 추가 유효성 검사는 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 펩 티 드에 대 한 필요할. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.
Introduction
CD8의 cytolytic (CTL) 잠재력을 평가 하기 위해 존재 하는 여러 프로토콜+ 또는 CD4+ T-셀. 이 평가 생체 외에서 제어 조건1,,23에서 쉽게 할 수 있습니다. 또한, 전염병 모델, LCMV, 고전적인 차동 CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르) 대상 셀을 표시를 사용 하 여 CTL 기능 검사 어디는 CFSE안녕-레이블이 지정 된 셀 펩 티 드 및 CFSElo펄스-레이블이 대상 셀 남아 있다 unpulsed. 셀에 1:1 비율로 주입은 그리고는 CFSE안녕의 손실에 대 한 평가-흐름 cytometry4펄스 대상 이라고 표시 된. 백신 및 제거 모델도 비슷한 전략에 vivo에서 두 CD8 살해의 평가 대 한 사용+ 와 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 NK 세포5,6. 이 강력한 분석 결과 이지만 대상 주입 전에 면역 시스템 프라임 전염 성 요원의 사용을 요구 한다.
이 프로토콜을 다른 한편으로, 아무 사전 감염 호스트의를 요구 하 고 대신 예방 접종 전략 대상 주입 전에 면역 체계를 이용 한다. 이 예방 접종 이라고 covax7, 수용 체 통행세 같이 7 (TLR7)의 구성 된 immunostimulatory 칵테일의 제공을 요구 하는 펩타이드 백신의 물 배합의 구성 주 작동 근 (imiquimod 크림), agonistic 안티-CD40 항 체, 그리고 interleukin-2 (일리노이-2) 펩 티 드 관련 못쓰게 하 고 강력한 면역 반응의 도출에 대 한 immunostimulatory 에이전트의 시너지 조합에 지도. 따라서,이 분석 결과 제공 CTL 함수의 빠른 판독 백신 3 일전 주입 대상 셀의 함수의 평가 대 한 셀에 함께 관리 된다. 또한, covax 못쓰게가 강하다 충분히 주입 후 4와 24 h 사이 끝났다 항 원 특정 T 세포의 살해 능력을 볼 수 있습니다.
이 프로토콜의 주요 한계는 타임 라인에서 vivo에서 항 원 및 가설 테스트에 적합 한 대상 살인의 탐지를 위한 식별 됩니다. 주의 깊은 평가 수행 해야 합니다, 유전 변경 뿐 아니라 항 원 강도에 유사로 T-세포에서 테스트 되 고 될 수 있습니다 대상 살인의 다른 타이밍 검출 필요로 하는 차동 CTL 함수. 또한, 예방 접종에 맞게 최적화 된 인간 흑색 종 항 원 glycopeptide 100 (hgp10025-33)에 대 한 펩 티 드의 적절 한 농도 동안 ovalbumin (OVA257-264)257-264 8,9 주어진된 연구에 더 적절 한 수 있습니다 다른 항 원 모델의 사용 추가 유효성 검사가 필요한 것 이다. 예상된 한 보조로는 covax와 함께에서 CTL effector 기능을 자극 하는 대상 항 용량 차이, 때문에 일리노이-2 복용량 농도 및 복용량 주파수의 최적화는 원하는 목표를 달성 하기 위해 필수적인 수 있습니다. 전반적으로,이 프로토콜 기능에서 vivo에서 살인의 빠른 평가 허용 하 고 어떤 주어진된 항 원에 적응 시킬 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 간단 하 고, 신중 하 게 수행 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 다음 테스트 되 고 항 원 특정 T 세포의 주입 covax 못쓰게 펄스 목표의 모든 살인을 볼 필요가 있다. 물 기반 covax 예방 접종 급성 염증 상태, 만성 염증 성 단계에 대 한 만듭니다 수 있지만 더 나은 생산할 수 있습니다 느린 원 출시 석유 기반의 접근 방식으로 단기 물에 기초를 둔 배합을 대체 결과<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 연구에 의해 지원 (A1R03AI120027 (RN)와 1R21AI20012 (RN)), 제도적 연구 그랜트 (RN), 시작 (RN) 부여, 그리고 MD 앤더슨 CIC 시드 부여 (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
References
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