דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9
Summary
זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.
Abstract
תאי גזע עובריים, המושרה pluripotent ניתן לחדש את עצמי, להבדיל לתוך מספר סוגי תאים של הגוף. תאים pluripotent הם לפיכך חמד לחקר רפואה רגנרטיבית, נמצאים כיום ניסויים קליניים עבור מחלות עיניים, סוכרת, מחלות לב והפרעות אחרות. היכולת להתמיין סוגי תאים מיוחדים בשילוב עם ההתקדמות האחרונה הגנום עריכה טכנולוגיות כולל מערכת CRISPR/רשויות אישורים מספק הזדמנויות נוספות תפירת הגנום של iPSC ליישומים מגוונים כולל מחלת דוגמנות, טיפול, ממתח מסלולים של בידול, שם כמה. בין הטכנולוגיות העריכה זמינים, CRISPR/Cas9 מ הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס התפתחה ככלי של בחירה עבור עריכת בייעודי לאתר של הגנום האיקריוטים. CRISPRs הינם נגישים בקלות, זול ויעיל מאוד של הנדסת עריכות יישוב. המערכת מחייבת של נוקלאז Cas9 מדריך רצף (20-mer) ספציפי אל המטרה גנומית סמוכים 3-נוקלאוטיד “הגולה” protospacer-צמוד-מוטיב (פאם) עבור המיקוד Cas9 מיקומה גנומית הרצוי, לצד מכשיר מעקב איגוד אוניברסלי Cas9 RNA ( יחד הנקראת RNA מדריך בודד או sgRNA). כאן אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור יעיל של iPSC מזין-עצמאית, ללא טביעת רגל. ומתארות מתודולוגיות לעריכה הגנום של iPSC באמצעות את מתחמי ribonucleoprotein (RNP) Cas9. הגנום עריכת פרוטוקול יעיל, יכול להיות מרובב בקלות על-ידי sgRNAs טרום-complexing עבור יעד אחד או יותר עם החלבון Cas9 ואספקה בו זמנית לתוך התאים. לבסוף, אנו מתארים גישה פשוטה עבור זיהוי ואפיון של iPSCs בעריכה הרצוי. יחדיו, האסטרטגיות מחולקת לרמות צפויים כדי לייעל את הדור ועריכה של iPSC ליישומים סעפת.
Introduction
תכנות מחדש של תאים סומטיים האנושי המדינה pluripotent על ידי ביטוי של התכנות גורמים יש מהפכה מחקר תאי גזע עם יישומים מידול המחלה, רפואה רגנרטיבית ו פיתוח תרופות. מספר שיטות התיכנות נגיפי זמינים עבור משלוח של התכנות גורמים ותפיק iPSCs, אבל התהליך עבודה אינטנסיבית, לא יעיל מאוד1. השיטות ויראלי, אבל יעיל, הם קשורים לבעיות של נגיף אינטגרציה ו- tumorigenicity-2,–3,–4. כתב יד זה, אנו מדווחים על השימוש של וירוס סנדאי cytoplasmic התכנות גורמים מתן ו הקמת קווי ללא טביעת רגל iPSC חוסר אינטגרציה של כל רצפי וקטור ויראלי לתוך הגנום שלהם5. סנדאי וירוס הוא וירוס רנ א הוא מדולל מחוץ לתא הציטופלסמה ~ 10 קטעים לאחר הזיהום ומייצרת גורמים התיכנות בשפע, שמוביל מהיר ויעיל התכנות6,7. IPSCs הוקמה יכול ואז ניתן בקלות לקביעת נטולת מזין בינוני כדי למנוע את השימוש בעכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) כ מזין תאים8.
בפרסום זה, בנוסף חלוקה לרמות את הוירוס סנדאי מתווכת התכנות, אנו מתארים גם פרוטוקול משופרת עבור עריכת iPSCs, אשר יש הפוטנציאל לספק תאים אנושיים ללא הגבלה עם שינויים גנטיים הרצוי למחקר. השתמשנו בטכנולוגיה CRISPR/Cas9 עבור השינוי של iPSCs, אשר נמצא כעת בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים כולל תוספות לדפוק על הדלת, הסתרה, מחיקות גנומית רחבת היקף, במאגר הספרייה הקרנת לגילוי גנים, הנדסה גנטית של מודל אורגניזמים רבים, ו ג’ין טיפול9,10,11. טכניקה זו כוללת הקמת מתחמי של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת-נגזר נוקלאז Cas9 20-מר מדריך RNAs להשיג זיהוי המטרה באמצעות בסיס תיאום עם רצף גנומית היעד הסמוכים סמוכים ב נוקלאוטיד protospacer 3′ רצף מוטיב (פאם). נוקלאז Cas9 המניע של נוקלאוטידים הפסקה נטושים זוגי ~ 3 מאתר פאם, אשר לאחר מכן תוקן בעיקר עד סוף שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) לשביל המוביל שהתוספות או המחיקות מסגרת קריאה פתוחה, ובכך פונקציונלי הסתרה של הגנים12.
פרוטוקול משופר שלנו כוללת את הפרטים עבור התרבות של תאים בלבלב האנושי, שלהם התכנות על mitotically לא פעיל העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של התכנות, עיבוד עוקבות לתרבות נטולת מזין על Matrigel, אפיון הוקמה iPSCs, CRISPR מודרכת RNA עיצוב ו הכנה, משלוח לתוך iPSCs כמו מתחמי RNP, תא בודד מיון כדי ליצור שורות המשובטים iPSCs הערוך, קל הקרנת זיהוי של עריכות, ואפיון של תא בודד שיבוטים. מחיקות גנומית נוצרו ביעילות במחקר זה המבוא של חלבונים Cas9, שני CRISPR sgRNA RNP מתחמי לזירוז מעברי זוגי נטוש (DSBs), מחיקה של ההתערבות קטע. שיטה זו הופך לרישית על השימוש של שני מדריכים ליצירת מחיקות מסגרת קריאה פתוחה, יעילות גבוהה של NHEJ שמוביל מספר נמוך של שיבוטים הזה צריך להתאפיין ולאחר סינון ראשוני קל של שיבוטים מאת נימי אוטומטית יחידת אלקטרופורזה, פרגמנט מנתח. אלה הגנום יעיל עריכה שיטות ליצירת מודלים מבוססי תאי גזע מחלות אנושיות תהפוך בקרוב גישה סטנדרטי, לא שגרתית במעבדה תאי גזע כלשהו. לבסוף הגנום מדויק עריכה יהפוך את זה אפשרי ללכת מעבר לתאי גזע המחלה דוגמנות, פוטנציאלי יכול לעזור לעודד טיפולים מבוססי תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תכנות מחדש של תאים סומטיים האנושי iPSCs סיפקה דחיפה גדולה בתחומי מחקר בסיסי ביולוגיה, רפואה אישית, מידול המחלה, פיתוח תרופות, רפואה רגנרטיבית16. שיטות רבות הנוכחי והשימוש בהם נפוץ דור אנוש iPSC דורשים שימוש וירוס עם הסיכון של אינטגרציה לתוך הגנום מארח או וקטורים episomal עם נמוך התכנות…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדה נתמך על ידי מענק בתר Nandal ד ר דני פחימה, וגראנט גישוש קרן מחקר תאי הגזע מרילנד ל BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
