Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9
Summary
Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.
Abstract
Células estaminais pluripotentes embrionárias e induzida pode auto renovar e se diferenciar em vários tipos de células do corpo. As células pluripotentes são assim, cobiçadas por pesquisa em medicina regenerativa e estão atualmente em ensaios clínicos para doenças oculares, diabetes, doenças cardíacas e outras doenças. O potencial de se diferenciar em tipos de células especializadas, juntamente com os recentes avanços no genoma de tecnologias, incluindo o sistema CRISPR/Cas de edição forneceram oportunidades adicionais para costurar o genoma de iPSC para variadas aplicações incluindo a doença de modelagem, terapia gênica e polarização vias de diferenciação, para citar alguns. Entre as tecnologias de edição disponíveis, o CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes tem emergido como uma ferramenta de escolha para a edição específica do genoma eucariótico. Os CRISPRs são facilmente acessível, barato e altamente eficiente em edições específicas de engenharia. O sistema requer uma nuclease Cas9 e uma sequência de guia (20-mer) específica para o destino de genômico adjacentes um 3-nucleotide “NGG” protospacer-adjacente-motivo (PAM) para direcionamento Cas9 para o locus genômico desejado, ao lado de um traçador de vinculação Cas9 universal (RNA chamada RNA guia única ou sgRNA). Aqui nós apresentamos um passo a passo do protocolo para a geração eficiente de iPSC alimentador independente e livre de pegada e descrever metodologias para edição de genoma de iPSC usando complexos Cas9 ribonucleoprotein (RNP). O genoma edição protocolo é eficaz e pode facilmente ser multiplexado por sgRNAs pre-complexantes para mais de um destino com a proteína Cas9 e simultaneamente entregando dentro das células. Finalmente, descrevemos uma abordagem simplificada para a identificação e caracterização de iPSCs com edições desejadas. Tomados em conjunto, as estratégias delineadas são esperadas para agilizar a geração e edição de iPSC para múltiplas aplicações.
Introduction
A reprogramação de células somáticas humanas ao estado pluripotentes pela superexpressão de reprogramação fatores revolucionou a investigação em células estaminais com aplicações em modelagem de doença, medicina regenerativa e desenvolvimento de drogas. Vários métodos de reprogramação não-virais estão disponíveis para entrega de reprogramação fatores e gerando iPSCs, mas o processo é a mão de obra intensiva e não muito eficiente1. Os métodos virais, apesar de eficiente, estão associados com problemas de integração do vírus e tumorigenicidade2,3,4. Neste manuscrito, relatamos o uso de citoplasmática vírus Sendai para entrega reprogramação fatores e estabelecer linhas de iPSC pegada livre que a falta de integração de qualquer sequências de vetor viral em seus genomas5. Sendai vírus é um vírus de RNA que é diluído de passagens de citoplasma ~ 10 célula após a infecção e produz fatores de reprogramação em abundância, levando a rápida e eficiente de reprogramação6,7. As iPSCs estabelecida pode então ser prontamente uma transição para médio alimentador-free para evitar o uso de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como alimentador células8.
Nesta publicação, além de delinear o vírus Sendai mediado reprogramação, descrevemos um protocolo melhorado para edição iPSCs, que tem o potencial para fornecer células humanas ilimitadas com modificações genéticas desejadas para a pesquisa. Nós usamos tecnologia CRISPR/Cas9 para a modificação de iPSCs, que agora está sendo usado para uma ampla gama de aplicações, incluindo bate-ins e nocautes, exclusões de genômicas em grande escala, biblioteca em pool de triagem para a descoberta do gene, genética de numerosos organismos-modelo e terapia de gene a9,10,11. Esta técnica envolve a formação de complexos de Streptococcus pyogenes-derivada Cas9 nuclease e 20-mer guia RNAs que alcançar o reconhecimento do alvo através de base-emparelhamento com sequência genômica alvo adjacente ao 3′ protospacer nucleotídeo adjacente sequência de motivo (PAM). A nuclease Cas9 induz um nucleotídeos de interrupção dupla encalhado ~ 3 do site da PAM, que é posteriormente reparados predominantemente por não-homóloga fim juntando o caminho (NHEJ) por inserções ou exclusões no quadro de leitura aberto e desse modo funcional nocaute de genes12.
Nosso protocolo melhorado inclui os detalhes para cultura de células de pâncreas humanas, sua reprogramação na mitotically inativado fibroblastos embrionários de rato (MEFs) para alcançar uma eficiência mais elevada de reprogramação, posterior adaptação à cultura livre de alimentador para Matrigel, caracterização de iPSCs estabelecido, CRISPR guiado RNA concepção e preparação, entrega em iPSCs como complexos de RNP, única célula classificação para gerar linhas clonais de iPSCs editado, fácil de rastreio e identificação de edições e caracterização de única célula clones. Exclusões de genômicas eficientemente foram geradas neste estudo pela introdução de proteína Cas9 e dois complexos de RNP sgRNA CRISPR para induzir quebras encalhadas dobro (DSBs) e exclusão da intervenção do segmento. Esse método capitaliza sobre o uso de dois guias para gerar exclusões no quadro de leitura aberto, alta eficiência de NHEJ levando ao baixo número de clones que precisa ser caracterizado e fácil triagem preliminar dos clones por capilar automatizado unidade de electroforese, analisador de fragmento. Estes genoma eficazes métodos para gerar modelos de doenças humanas baseadas em células-tronco de edição logo se tornará uma abordagem padrão e rotina em qualquer laboratório de células-tronco. Finalmente, genoma preciso edição tornará possível ir além da modelagem de doença de células-tronco e potencialmente poderia ajudar a catalisar terapias baseadas em células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reprogramação de células somáticas humanas para iPSCs tem proporcionado um grande impulso para os campos de pesquisa de biologia básica, medicina personalizada, modelagem de doenças, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa16. Muitos métodos atuais e amplamente utilizados de iPSC humana geração requerem o uso de vírus com o risco de uma integração do genoma do hospedeiro ou epissomal vetores com baixa eficiência de reprogramação. Aqui, apresentamos um método eficiente para…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho no laboratório foi apoiado pela bolsa de pós-doutorado para Dr. Anjali Nandal e grant exploratória de Maryland Stem Cell Research Fund para BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
