Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing
Summary
Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo’s met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo’s waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.
Abstract
Het volledige genoom van de channel catfish, Ictalurus punctatus, heeft sequenced, wat leidt tot meer kansen voor de studie van channel catfish genfunctie. Gene knock-out is gebruikt voor het bestuderen van deze gene functies in vivo. De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) systeem is een krachtig hulpmiddel gebruikt voor het bewerken van genomic opeenvolgingen van DNA om te veranderen van de genfunctie. Terwijl de traditionele benadering is geweest om CRISPR/Cas9 mRNA in de eencellige embryo’s door middel van microinjection, kan dit een langzaam en inefficiënt proces in meerval. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor microinjection van channel catfish embryo’s met CRISPR/Cas9 eiwit beschreven. Kort, eieren en sperma werden verzameld en dan kunstmatige bevruchting uitgevoerd. Bevruchte eieren werden overgedragen aan een petrischaal met Holtfreter de oplossing. Geïnjecteerd volume was gekalibreerd en vervolgens begeleiden RNAs/Cas9 gericht op de tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM 1) gen en rhamnose bindend lectine (RBL) gen werden microinjected in de dooier van één-cel embryo’s. Het gen raakeffect was succesvol want microdeleties werden bevestigd door DNA sequentiebepaling. De voorspelde eiwit sequentie wijzigingen als gevolg van deze mutaties frameshift opgenomen en afgekapt eiwit vanwege voortijdige stop codonen.
Introduction
Microinjection is een gemeenschappelijk laboratorium techniek gebruikt voor het leveren van een kleine hoeveelheid van een stof zoals DNA, RNA, eiwitten en andere macromoleculen in cellen of embryo’s via een glazen capillaire1. Microinjection wordt uitgevoerd met behulp van speciale apparatuur installatie met inbegrip van een microinjector, micromanipulator en een Microscoop2. De techniek is gebruikt door onderzoekers genetisch wijzigen vele organismen door middel van de generatie van transgenics, gene uitsparingen en gentherapie, met als doel inzicht in de dynamiek van intracellulaire componenten3,4 , 5.
De channel catfish (Ictalurus punctatus) is de meest populaire meerval soorten in de aquacultuur en recreatieve visserij-activiteiten in de Verenigde Staten. Er is een toenemende behoefte aan de studie van functionele genomica in channel catfish, en sequentiebepaling van het volledige genoom van channel catfish verbetert het nut van de recente vooruitgang in genoom editing tools6,7. Begrip van de genfunctie zou niet alleen het verrijken van het onderzoek dat wordt gevoerd op meerval, maar kan ook leiden tot meer effectieve genetische verbetering programma’s ter verbetering van de meerval industrie. Als kritische genen voor een bepaalde eigenschap van belang worden geïdentificeerd, kunnen zij worden gebruikt genetisch meerval om productie te verbeteren door het genoom bewerken voor het genereren van positieve allelen, selectie voor deze allelen, het onderdrukken van de schadelijk allelen, overbrengen het gunstige allel via Transgenese, of een combinatie van deze opties. Combineren de beste genen voor verschillende commercieel gunstige eigenschappen van verschillende soorten in één vis zou de productiviteit en winstgevendheid van vis productie operaties8, aanzienlijk verbeteren.
Gene knock-out is een directe methode om te studeren gene functies in vivo. Mutaties op DNA niveau zal worden overgenomen door toekomstige generaties die de studie van hun effecten in verschillende generaties zal vergemakkelijken. Verschillende genoom bewerkingshulpmiddelen zijn ontwikkelde inclusief zink vinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs), en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9 ) systeem9,10,11,12.
Het systeem van CRISPR/Cas9 is een krachtige en efficiënte tool die is gebruikt voor het bewerken van genomic DNA-sequenties, met inbegrip van gene knock-out in vis door RNA-geleide site-specific DNA decollete5,13. Het systeem bestaat uit een gids-RNA (gRNA), die de gerichte volgorde in het genoom en een DNA endonuclease enzym, Cas9 bepaalt. De CRISPR/Cas9-systeem kan worden ontworpen om het richten van een willekeurige tekenreeks in het genoom met verschillende voordelen ten opzichte van ZFNs en TALENs: (1) lager kosten (2) gemakkelijker engineering (3) meer specifieke binding van RNA gids in de reeks van de doelgroep, en verminderd af-target mutaties (4) meerdere reeksen kunnen worden gericht met verschillende gRNA hetzelfde tempo tijd (5) hoge mutagenese in genen die kon niet worden gemuteerd door TALENs, en (6) verbeterde germline transmissiesnelheid van mutaties voor tot 6-fold in vergelijking met ZFNs en TALENs14, 15,16,17,18.
De belangrijkste alternatieve methode voor microinjection is electroporation, waarin elektrische impulsen worden toegepast op embryo’s of cellen membraan permeabiliteit en de opname van biologische moleculen19,20te verhogen. Verschillende transgene vis waren gegenereerd met behulp van electroporation zoals medaka (Oryzias latipes), zebravissen (Danio rerio), chinook zalm (Oncorhynchus tshawytscha), channel catfish, zeebrasem (Sparus sarba), en gemeenschappelijke carp (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Electroporation is gebruikt voor het leveren van de plasmide DNA, RNA en Cas9 eiwitten voor gene knock-out. In de cellen van zoogdieren, Cas9/gRNA plasmide DNA, Cas9 mRNA/gRNA, en Cas9 eiwit/gRNA complexen werden geleverd met behulp van electroporation en de mutagenese tarieven waren hoogste met behulp van Cas9 eiwit/gRNA complexen voor meeste electroporation voorwaarden getest27. TALENs uiten constructies werden in de ascidian chordate (Ciona intestinalis), electroporated in bevruchte eieren voor het opwekken van knockout van meerdere genen28. ZFNs uiten plasmide constructies waren electroporated om knock-out luteïniserend hormoon in channel catfish29. Echter zodra ingevoerd in de cel, plasmide constructies zal moeten worden herschreven als RNA en vertaald naar functionele eiwitten voordat ze kunnen richten op de gewenste opeenvolging van DNA, die zou waarschijnlijk het vertragen van de tijd van de mutagenese ten opzichte van microinjection van RNA / eiwit. Als een embryo ontwikkelt zich, stijgt vertraagde mutagenese de mozaïcisme van ingespoten oprichters. Transgene expressie is daarnaast onwaarschijnlijk om de expressie niveau mogelijk met microinjection, verlagen de mutagenese efficiëntie te bereiken.
Als een middel voor de invoering van genoom bewerkingsgereedschappen in cellen, heeft microinjection diverse voordelen ten opzichte van electroporation. Genoom bewerken van moleculen kan betrouwbaar worden ingevoerd in cellen of embryo’s door middel van microinjection30. Minder materiaal injectie nodig is. Het is gemakkelijk om te bepalen van de hoeveelheid materiaal geïnjecteerd. Hogere mutatie tarieven met lage mozaïcisme in de oprichter vis kunnen worden bereikt die germline transmissie van mutaties op F1zou verbeteren. Minder oprichter vis moet worden geanalyseerd om te produceren van de eerste generatie, als gevolg van het hogere tarief van de mutatie. Electroporation moeten meer oprichter vis worden geanalyseerd die kosten zal verhogen. Het voortbestaan van channel catfish microinjected embryo’s is echter lager dan electroporated ones, hoewel dit kan worden overwonnen door het injecteren van meer embryo’s31,32. In channel catfish, voortbestaan van embryo’s varieerden van 16 tot 55%, afhankelijk van de genen gericht dooier-microinjected en de dosering van gRNA/Cas9 eiwit32.
Regelmatige microinjection van meerval embryo’s is technisch veeleisend en tijdrovend, een snelle en efficiënte CRISPR/Cas9 eiwit protocollen protocol wordt echter gepresenteerd voor channel catfish embryo’s. Dit protocol vereist minder tijd en deskundigheid, aangezien de CRISPR/Cas9 eiwit oplossing wordt geïnjecteerd in de dooier van één cel embryo’s. Honderden bevruchte eieren kunnen worden geïnjecteerd in 1 h (ongeveer de tijd die nodig is voor de eerste celdeling te voorkomen). Voor het valideren van het protocol, werden twee ziekte gevoeligheid-gerelateerde genen gevloerd in channel catfish, de tol/interleukine 1 receptor domein-bevattende adapter molecuul (TICAM1) gen en het rhamnose bindend lectine (RBL) gen. TICAM 1 is betrokken bij de signalering traject gestart door toll-like receptor (TLR) 3. In channel catfish was TICAM 1 dramatisch upregulated na bacteriële challenge met Edwardsiella ictaluri, terwijl het was werden in blue catfish, een tot en met E. ictaluri33resistente soorten. RBL speelt een belangrijke rol in de vroege infectie met Flavobacterium columnare, de verwekker van de ziekte van de columnaris, waar acute en robuuste opregulatie werd opgenomen in een columnaris-gevoelige channel catfish stam in vergelijking met een columnaris-resistente stam34.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een gedetailleerd protocol voor microinjection van channel catfish embryo’s te bereiken van gen knock-out werd gepresenteerd. Injectie van CRISPR/Cas9 eiwitten in de dooier is veel eenvoudiger, bespaart u tijd en vereist geen uitgebreide opleiding in vergelijking met de microinjecting van de blastodiscus van het embryo één-cel, die de gemeenschappelijke techniek voor de meeste genenoverdracht en gene bewerken met vis 30 , 42. het huidige protocol bewezen succes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de USDA-NIFA award 2015-67015-23488 naar Roger Cone. De auteurs bedanken Dr. Ronald Phelps voor de beschrijving van brood voorraad selectiecriteria in de video. Ahmed Elaswad en Karim Khalil bedank de Egyptische culturele en educatieve Bureau in Washington DC voor de financiering van hun doctoraatsonderzoek.
Materials
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
References
- Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
- Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
- Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
- Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
- Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
- Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
- Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
- Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
- Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
- Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
- Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
- Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
- Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
- Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
- Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
- Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
- Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
- Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
- Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
- Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
- Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
- Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
- Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
- Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
- Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
- Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
- Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
- Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Génétique. 197 (2), 591-599 (2014).
- Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
- Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
- Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
- Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
- Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5’splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).
