CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection
Summary
CRISPR/Cas9 시스템을 사용 하 여 채널 메기 배아에서 유전자 편집에 대 한 간단 하 고 효율적인 microinjection 프로토콜 제공 됩니다. 이 프로토콜에서 RNAs 가이드 및 Cas9 단백질 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected 했다. 이 프로토콜은 두 채널 메기 면역 관련 유전자를 노크 하 여 검증 되었습니다 않았습니다.
Abstract
채널 메기, Ictalurus punctatus의 완전 한 게놈은 되었습니다 시퀀싱, 공부 채널 메기 유전자 기능을 위한 큰 기회를 선도. 유전자 녹아웃은 공부 이러한 유전자 기능 비보를 사용 되었습니다. 클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템은 유전자의 기능을 변경할 하 genomic DNA 시퀀스를 편집 하는 데 사용 하는 강력한 도구입니다. 전통적인 접근은 microinjection 통해 단일 셀 배아로 CRISPR/Cas9 mRNA를 소개 하 동안, 메기에 느리고 비효율적인 프로세스 수 있습니다. 여기, CRISPR/Cas9 단백질으로 채널 메기 배아의 microinjection에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 계란과 정자 수집 하 고 다음 인공 수정 수행 했다. 수정 된 난 자는 Holtfreter의 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시로 옮겨 졌다. 사출 볼륨 보정 했다 고 RNAs/Cas9 전화/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM 1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자 1 셀 배아의 노 른 자에 microinjected은 대상으로 안내 합니다. 유전자 녹아웃 indels DNA 시퀀싱에 의해 확인 되었다 성공 했다. 이러한 돌연변이 인해 예측된 단백질 시퀀스 변경 frameshift 포함 하 고 조 정지 codons 인해 단백질을 잘립니다.
Introduction
Microinjection 셀 이나 유리 모 세관1통해 배아에 DNA, RNA, 단백질, 및 다른 고분자와 같은 물질의 작은 금액을 제공 하는 일반적인 실험실 기술 이다. Microinjection는 microinjector, micromanipulator, 현미경2등 특수 장비 설치를 사용 하 여 수행 됩니다. 기술은 유전자 세포내 구성 요소3,4 의 역학을 이해 하는 것을 목적으로 제 닉, 유전자 녹아웃, 유전자 치료의 세대를 통해 많은 유기 체를 수정 하려면 연구자에 의해 사용 되었습니다. , 5.
채널 메기 (Ictalurus punctatus)은 미국에서 레크리에이션 어업 활동과 양식에서 가장 인기 있는 메기 종. 거기 증가 하는 필요가 있는 채널 메기, 기능 유전체학을 연구 하 고 채널 메기의 완전 한 게놈의 연속 게놈 편집 도구6,7의 최근 발전의 유틸리티를 강화 한다. 유전자 기능을 이해만 메기에서 수행 되는 연구를 풍요롭게 하지 것 이라고 하지만 또한 이어질 수 더 효과적인 유전자 개선 프로그램 메기 산업을 향상 시키기 위해. 관심의 특정된 특성에 대 한 중요 한 유전자를 파악 하는 그들은 유전자 선택 전송 해로운 대립 유전자를 억제 하는 이러한 대립에 대 한 유익한 대립 유전자를 생성 하 게놈 편집을 통해 메기 생산을 개선 하기 위해 사용할 수 있습니다. transgenesis, 또는 이러한 옵션의 몇 가지 조합을 통해 대립에서 유리한 유전자 한 물고기의 다른 종에서 다른 상업적으로 유리한 특성에 대 한 최고의 유전자를 결합 하 여 생산성과 물고기 생산 작업8의 수익성을 크게 향상 시킬 것 이다.
유전자 녹아웃 유전자 기능 비보를 공부 하는 직접적인 방법입니다. 미래 세대는 다른 세대에 그들의 효과의 연구를 촉진 하 여 DNA 수준에서 돌연변이 상속 됩니다. 다른 게놈 편집 도구 개발된 포함 아연 손가락 nucleases (ZFNs), 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) 되었고 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복/CRISPR-관련 단백질 9 (CRISPR/Cas9 클러스터 ) 시스템9,10,,1112.
CRISPR/Cas9 시스템은 강력 하 고 효율적인 도구입니다 RNA 기반 사이트 DNA 분열5,13물고기에 유전자 녹아웃을 포함 하 여 게놈 DNA 시퀀스를 편집 하는 데 사용 되었습니다. 게놈에 있는 DNA endonuclease 효소, Cas9 대상된 시퀀스를 결정 하는 가이드 RNA (gRNA) 시스템에 의하여 이루어져 있다. CRISPR/Cas9 시스템 ZFNs 및 TALENs 여러 이점을 게놈에서 어떤 시퀀스를 대상으로 디자인 될 수 있다: (1) 낮은 비용 (2) 쉽게 (3) 더 특정 바인딩 대상 시퀀스에 가이드 RNA의 엔지니어링 및 감소 대상에서 돌연변이 (4) 여러 시퀀스 수 없습니다 변경 될 TALENs, 그리고 돌연변이 대 한 최대의 (6) 생식 향상 된 전송 속도 의해 접을 ZFNs 및 TALENs14에 비해 유전자에 동일한 시간 (5) 높은 mutagenesis 속도로 다른 gRNA와 함께 타겟이 될 수 있습니다. 15,,1617,18.
Microinjection에 대 한 주요 대체 방법은 이다 electroporation, 전기 자극 배아 또는 막 침투성 및 생물 학적 분자19,20의 통풍 관을 증가 하는 셀에 적용 됩니다. 여러 유전자 변형 물고기 electroporation 채널 메기, 도미 (Sparus sarba), 치 누 크 연어 (Oncorhynchus tshawytscha), zebrafish (Danio rerio), 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 생성 된 및 일반적인 잉어 (Cyprinus 카 르 피 오)21,22,23,,2425,26.
Electroporation은 플라스 미드 DNA, RNA, 및 Cas9 단백질 유전자 녹아웃에 대 한 제공을 사용 되었습니다. 포유류 세포, Cas9/gRNA 플라스 미드 DNA에서 Cas9 mRNA/gRNA, 및 Cas9 단백질/gRNA 단지 electroporation를 사용 하 여 전달 했다 되었고 mutagenesis 요금 대부분 electroporation 테스트 조건27Cas9 단백질/gRNA 복합물을 사용 하 여 높은. Ascidian 척 (Ciona intestinalis) 구문 표현 TALENs 여러 유전자28의 녹아웃을 유도 하기 위해 수정 된 계란에 electroporated 했다. ZFNs 플라스 미드 구조 표현 electroporated 채널 메기29황 호르몬 밖으로 노크를 했다. 그러나, 일단 세포에 도입, 플라스 미드 구조 필요 합니다 RNA를 변하게 하 여 RNA의 microinjection에 비해 mutagenesis의 시간 지연 가능성이 것 원하는 DNA 시퀀스 대상 기능 단백질에 변환 / 단백질입니다. 배아 개발 지연된 mutagenesis 주입된 설립자의 mosaicism을 증가 합니다. 또한, 유전자 변형 식 가능 microinjection, mutagenesis 효율을 낮추는 식 수준 달성 가능성이 크다.
수단으로 세포로 게놈 편집 도구를 도입, microinjection electroporation에 몇몇 이점이 있다. 게놈 분자 편집 셀 또는 microinjection30통해 배아에 안정적으로 도입 될 수 있습니다. 적은 주입 재료 필요 합니다. 주입 하는 재료의 양을 결정 하는 것이 쉽습니다. 높은 돌연변이 설립자 물고기에 낮은 mosaicism 요금 수 F1에 돌연변이의 생식 전송을 개선 하는 것을 달성. 적은 설립자 물고기 생산 1 세대의 높은 돌연변이 비율 때문에 분석 될 필요가 있다. Electroporation, 더 많은 설립자 물고기 필요가 분석 비용을 증가 합니다. 그러나, microinjected 채널 메기 배아의 생존 보다 낮습니다 electroporated 것 들, 하지만이 더 많은 배아31,32를 주입 하 여 극복할 수 있습니다. 채널 메기, 노 른 자 microinjected 태아 대상 유전자에 따라 55%, 16에서 240의 생존 및 gRNA/Cas9 단백질32의 복용량
그러나 메기 배아의 일반 microinjection는 기술적으로 요구 하 고 시간이 걸리고,, 신속 하 고 효율적인 CRISPR/Cas9 단백질 microinjection 프로토콜은 채널 메기 배아에 대 한. 이 프로토콜 CRISPR/Cas9 단백질 해결책은 한 셀 배아의 노른자위에 주입 이후 적은 시간과 전문성을 요구 한다. 수정 된 난 자 수백 1 h (약 발생을 첫 번째 세포 분열에 필요한 시간)에 주입 수 있습니다. 프로토콜의 유효성을 검사 하려면 두 질병 민감성 관련 유전자 채널 메기, 수신자/인터 루 킨 1 수용 체 포함 하는 도메인 어댑터 분자 (TICAM1) 유전자와 rhamnose 바인딩 lectin (RBL) 유전자에 제압 했다. TICAM 1은 신호 통로 통행세 같이 수용 체 (TLR) 3에 의해 시작에 관여. 채널 메기, TICAM 1는 극적으로 upregulated downregulated 블루 메기, E. ictaluri33종 저항에 했다 Edwardsiella ictaluri, 세균 문제를 다음 이었다. 어디 급성 RBL Flavobacterium columnare의 columnaris 병의 원인이 되는 대리인으로 초기 감염에 중요 한 역할을 재생 하 고 강력한 upregulation에 비해 columnaris 취약 채널 메기 스트레인에 기록 된 한 columnaris 저항 스트레인34
Protocol
Representative Results
Discussion
채널 메기 배아 유전자 녹아웃을 달성 하기의 microinjection에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 했다. 노 른 자에 CRISPR/Cas9 단백질의 주입 훨씬 간단 하 게, 시간, 그리고 대부분 유전자 이동 및 유전자 물고기와 편집을 위한 일반적인 기법 1 셀 배아의 blastodisc microinjecting에 비해 광범위 한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 30 , 42. 현재 프로토콜 채널 메기 TICAM 1 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 농 무부 NIFA 수상 2015-67015-23488 로저 콘에 의해 투자 되었다. 저자는 박사 로널드 펠프스 비디오에 가만히 재고 선택 기준의 설명 감사. 아메드 Elaswad과 카림 칼 릴 박사 연구 자금에 대 한 워싱턴 DC에서 이집트 문화 및 교육 국에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
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