Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

Résumé

Un protocole de microinjection simple et efficace pour l’édition de gène dans des embryons de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9 est présenté. À ce protocole, le guide des ARN et protéine Cas9 étaient micro dans le jaune d’embryons unicellulaire. Ce protocole a été validé par assommant deux gènes immunitaires de barbue.

Résumé

Le génome complet de la barbue de rivière, Ictalurus punctatus, a été séquencé, menant à plus grandes possibilités pour l’étude de la fonction du gène barbue. Knock-out du gène a été utilisé pour étudier ces fonctions de gènes in vivo. Le cluster régulièrement entrecoupées de protéine de courtes répétitions/CRISPR palindromique associé 9 (CRISPR/Cas9) système est un outil puissant permettant de modifier les séquences d’ADN génomique pour altérer la fonction du gène. Alors que l’approche traditionnelle a été d’introduire CRISPR/Cas9 ARNm dans des embryons de cellule unique entre la microinjection, cela peut être un processus lent et inefficace dans le poisson-chat. Ici, un protocole détaillé pour microinjection des embryons de barbue avec CRISPR/Cas9 protéine est décrite. Brièvement, œufs et du sperme ont été recueillie et puis artificielle fécondation effectuée. Les œufs fécondés sont transférés à une boîte de Pétri contenant la solution de Holtfreter. Volume d’injection a été étalonné et ensuite guider RNAs/Cas9 ciblant le gène de la molécule (1 TICAM) adaptateur contenant du domaine récepteur péage/interleukine 1 et gène de rhamnose binding lectine (RBL) ont été microinjected dans le jaune d’embryons unicellulaire. Le coup de grâce de gène a réussi comme indels ont été confirmés par le séquençage de l’ADN. Les altérations de séquence de protéine en raison de ces mutations inclus déphasage et tronquée de protéine en raison de codons stop prématurés.

Introduction

Microinjection est une technique courante de laboratoire utilisée pour livrer une petite quantité d’une substance telle que l’ADN, ARN, protéines et autres macromolécules dans des cellules ou des embryons dans un capillaire de verre¹. Microinjection est effectuée à l’aide de la configuration d’équipements spéciaux dont un microinjector micromanipulateur et un microscope². La technique a été utilisée par les chercheurs de modifier génétiquement les nombreux organismes grâce à la génération de transgénèse, débouchures de gènes et thérapie génique, dans le but de comprendre la dynamique des composants intracellulaires

Protocole

Cette expérience a été menée au poisson Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Université d’Auburn, Alabama. Tous les protocoles expérimentaux utilisés dans cette expérience ont été approuvées par l’Auburn University Institutional Animal Care et le Comité de l’urbanisme (UA-IACUC) avant le début de l’expérience. Une liste du matériel et des fournitures utilisées dans cette expérience se trouvent dans la Table des matières. Voici les étapes et les procédures de préparation et de la microinjection d’embryons unicellulaire barbue tel qu’illustré à la Figure 1.

1. sélection de titres et de fra....

Résultats

Pour démontrer l’efficacité du protocole microinjection, gRNAs conçus pour cibler le barbue sans frais/interleukine 1 gène du récepteur contenant du domaine adaptateur molécule (TICAM1) et la rhamnose binding lectine (RBL) gène étaient micro.

TICAM 1
Séquençage de l’ADN des vecteurs de colonies individuelles de produits PCR regroupées, clonés a révélé les indel mutations induites dans le gène TICAM 1. Le taux.......

Discussion

Un protocole détaillé pour microinjection d’embryons de barbue d’atteindre knock-out du gène a été présenté. Injection de la protéine CRISPR/Cas9 dans le jaune d’oeuf est beaucoup plus simple, fait gagner du temps et ne nécessite pas de formation approfondie par rapport à microinjecting le blastodisc de l’embryon unicellulaire, qui est la technique courante pour la plupart de transfert de gène et gène édition avec poisson ^{30 , 42}. le protocole actuel s’est avérée.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Implant Reproboost	Centre de biotechnologie		Analogue de l’hormone de libération de l’hormone lutéinisante (LHRHa) pour l’induction de l’ovulation chez les femelles de poisson-chat de rivière
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		Pour la sédation des poissons géniteurs lors de l’injection d’hormones et de l’épilation des œufs.
Rouge de phénol	Sigma-Aldrich	P0290	0,5 %, filtre stérile
Stéréomicroscope	Olympus	213709	Pour visualiser les œufs lors de la micro-injection
Micro-injecteur	ASI-Applied Scientific Instrumentation  ;	Modèle MPPI-3	Pour l’administration du matériel d’injection dans les embryons
Micromanipulateur	ASI-Applied Scientific Instrumentation  ;	Modèle MM33  ;	Pour tenir et contrôler le mouvement de l’aiguille d’injection.
Eppendorf Microloader	Eppendorf	5242956.003	Pour le chargement de la solution d’injection dans les aiguilles de microinjection.
Extracteur d’aiguille vertical	David Kopf Instruments	Modèle 720	Pour tirer les aiguilles de micro-injection
Protéine Cas9	PNA Bio Inc.	CP01	Protéine recombinante Cas9 de Streptococcus pyrogenes.
Expand Système PCR High FidelityPLUS	; Roche Diagnostics, États-Unis		Pour la PCR et l’amplification de matrices d’ADN à utiliser dans la préparation d’ARNg
Capillaires en verre borosilicaté	Fisher Scientific		Diamètre extérieur (OD) de 1 mm, pour la fabrication d’aiguilles de micro-injection.
Boîte de Pétri	VWR	25384-302	Pour maintenir les embryons pendant la micro-injection.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Shortening végétal pour enrober les frayères et les boîtes de Pétri
solution de Holtfreter	Made Home 59		mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 2,4 mM de NaHCO3, 0,76 mM de CaCl2, 1,67 mM de MgSO4 pour incuber les embryons micro-injectés jusqu’à l’éclosion.
Hyclate de doxycycline USP (monohydrate)	Letco Medical	690904	Antibiotique ajouté à la solution de Holtfreter à 10 ppm pour prévenir les infections bactériennes.

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