Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

Summary

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood – brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Abstract

El objetivo de este protocolo presenta un procedimiento optimizado para la purificación y cultivo de pBECs y establecer en vitro barrera blood – brain (BBB) basados en pBECs en mono-cultura (MC), MC con medio acondicionado astrositos (ACM), y co-cultivo (NCC) con astrocitos de porcino sin contacto o rata origen. pBECs fueron aisladas y cultivadas de los fragmentos de los capilares de las cortezas cerebrales de 5-6 meses de edad los cerdos domésticos. Estos fragmentos fueron purificados por el retiro cuidadoso de meninges, de aislamiento y de homogeneización de la materia gris, la digestión enzimática, filtración y centrifugación. Para eliminar las células contaminantes, los fragmentos capilares fueron cultivados con puromicina medio. Cuando confluentes de 60-95%, pBECs de los fragmentos capilares fueron pasados a filtro de membrana permeable inserta y establecido en los modelos. Para aumentar la tensión de barrera y fenotipo característico BBB de pBECs, las células fueron tratadas con los siguientes factores de diferenciación: membrana florescente 8-CPT-cAMP (campo abreviado aquí), hidrocortisona y un inhibidor de la fosfodiesterasa, RO 20-1724 (RO). El procedimiento se llevó a cabo durante un período de 9-11 días, y cuando se establece el modelo de la NCC, los astrocitos se cultivaron 2-8 semanas de antelación. Cumplimiento de los procedimientos descritos en el protocolo ha permitido el establecimiento de las capas endoteliales con permeabilidad paracelular altamente restringida, con la CNC modelo mostrando una resistencia eléctrica (TEER) de promedio transendothelial de 1249 ± 80 Ω cm ²y la permeabilidad paracelular (P_app) para Lucifer amarillo de 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm seg^-1 (media ± SEM, n = 55). La evaluación adicional de este fenotipo de pBEC demostró buena expresión de la proteínas de Unión estrecha claudin 5, ZO-1, occludin y adherens Unión proteína catenina p120. El modelo presentado puede utilizarse para una variedad de estudios de la BBB en salud y enfermedad, y con la permeabilidad paracelular altamente restrictiva, este modelo es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular.

Introduction

Estructura celular y función de la Barrera Blood – Brain

En la interfaz del sistema nervioso central y circulatorio (CNS), el BBB actúa como un sitio regulador clave para homoeostatic control del microambiente del CNS, que es esencial para el correcto funcionamiento y protección del sistema nervioso. El sitio de la BBB es las células endoteliales que recubren el lumen del vaso sanguíneo. En los capilares del cerebro, las células endoteliales forman a uniones estrechas intercelulares complejas y patrones de expresión fuertemente polarizada de los transportadores de influjo y eflujo particular garantizar transporte molecular altamente específico entre la sangre y el cerebro ¹. Los componentes estructurales de los complejos de Unión estrecha incluyen proteínas de la familia occludin y claudin, zonula occludens (ZO) proteínas, cingulin y asociados a las moléculas de la adherencia junctional (mermeladas). Claudin 5 es particularmente importante en la restricción de junctional paracelular. Inducción y mantenimiento de este característico fenotipo endotelial BBB implican interacciones dinámicas con las células circundantes, como pericitos, astrocitos, neuronas y las membranas del sótano, que junto con cerebro endothelial las células forma el neurovascular unidad (NVU)^2,3. Los mecanismos implicados en estas interacciones no se entienden todavía completamente, pero incluyen intercambio de señales químicas entre las células, que permite la modulación de la permeabilidad BBB en el corto plazo e induce a largo plazo BBB características⁴. Astrocitos especialmente son conocidos por contribuir al fenotipo de célula endotelial cerebral y son una fuente de factores reguladores como neurotrófico glial-derivado (afecta el cAMP intracelular) de factor⁵, de factor de crecimiento básico del fibroblasto⁶, hidrocortisona⁷y transformación del factor de crecimiento β (TGF-β)⁸. El efecto de TGF-β, sin embargo, ha sido debatido⁹.

De In Vivo que In Vitro BBB

In vivo estudios siguen proporcionan valiosa información sobre la biología BBB. Sin embargo, los modelos de cultura de célula pueden proporcionar perspectivas adicionales y constituyen herramientas útiles para la comprensión detallados aspectos moleculares y funcionales de la BBB en salud y enfermedad. Aunque las complejas interacciones entre los tipos de células y componentes de la BBB son difíciles de lograr totalmente en modelos en vitro , se ha producido, desde la primera purificación de las células endoteliales cerebrales y aplicación de estos en monocultivos ^{10 , 11 , 12}, amplio desarrollo de los procedimientos de purificación y condiciones de crecimiento de la BBB modelos cultura, resultando en una mayor semejanza a la barrera en vivo de la célula. Los modelos utilizados en vitro BBB se basan en células primarias de origen bovino, porcino y roedor y en líneas celulares inmortalizadas. Cada modelo tiene diferentes ventajas y desventajas. Para la comparación y el modelo de opción, los marcadores de validación como expresión de BBB enzimas, transportadores, receptores y proteínas estructurales se utilizan para crear descripciones de los actuales modelos establecidos¹.

Objetivo del Protocolo de

Una característica importante de la BBB es barrera tirantez y TEER alta, sin embargo, un gran número de los modelos disponibles no reflejan bien los niveles en vivo . Incorporar el desarrollo y optimización de las contribuciones de varios laboratorios, el objetivo de este protocolo es presentar un método para establecer un alto TEER en vitro BBB modelo basado en la pBECs primaria en MC con o sin ACM o en NCC con primaria astrocitos de rata o de origen porcino. Los procedimientos aplicados y el establecimiento del modelo incluyen esfuerzos para eliminar las células contaminantes y mejorar la diferenciación de pBECs en un fenotipo BBB. Este trabajo ha dado como resultado el establecimiento de modelos TEER fiables y de alta permeabilidad paracelular baja y buena expresión funcional de las proteínas clave de Unión estrecha, transportadores y receptores. Sin embargo, como los astrocitos son un factor que contribuye al fenotipo de células endoteliales cerebrales, las tres condiciones diferentes de la cultura representan tres diferentes fenotipos de las células endoteliales del cerebro. El modelo de la NCC es especialmente útil para estudios de ciertos mecanismos especializados involucrados en el descubrimiento de medicamentos, estudios de transporte y tráfico intracelular, así como para la investigación de las interacciones célula-célula donde es la máxima expresión de características BBB ventajoso.

Origen e historia del Protocolo

El modelo de pBEC descrito aquí se basa en el modelo porcino desarrollado en los laboratorios Eisai (Londres) por el Dr. Louise Morgan y sus colegas, whichis basada en un exitoso anterior cerebro bovino células endoteliales modelo¹³. El método original de preparación de la célula fue una filtración de dos etapas utilizando nylon mallas para atrapar los microvessels, seguidos por un paso subculturing para mejorar la pureza. En el anterior desarrollo del método, tirantez óptima de fenotipo y barrera BBB fueron alcanzados por el crecimiento en medio suplementado, incluyendo ACM. R. Skinner hicieron otras modificaciones al método en el laboratorio del Prof. N. Rothwell en Manchester UK^14,15. El método fue adoptado por el laboratorio Abbott, KCL Londres, donde Patabendige hecho significativamente más sencillo de preparar, evitando el uso de los astrocitos o ACM y eliminando las células contaminantes tales como del pericitos con puromicina. Los primeros papeles confirmó que el modelo de MC conserva varias características importantes de la en vivo BBB, como uniones estrechas eficaces, sistemas de transporte de la membrana mediada por receptor transcitosis^{16,17 , 18 , 19 , 20}. más tarde S. Yusof otra vez probado co-cultivo astrositos y mejoró significativamente TEERAN, así que esta es la variante preferida actualmente utilizada en el laboratorio Abbott del²¹. El modelo ha sido exitosamente transferido a la Nielsen M. laboratorio en Aarhus, donde otras modificaciones han sido introducidos (este protocolo), incluyendo la simplificación gris materia extracción, usando la malla solamente un paso de filtración y un paso de la capa de filtro único la combinación de colágeno y fibronectina. El procedimiento aplicado para el aislamiento de astrocitos porcinos (este protocolo) se basó en los protocolos desarrollados por el laboratorio T. Moos en Aalborg, descrito por Thomsen et al²². El TEER y otras propiedades del modelo generado en Londres y Aarhus son similares, lo que da confianza a la idea de que el modelo se transfiere fácilmente entre laboratorios y responde bien a la observación cuidadosa y la racionalización de los pasos del método. De hecho, Yusof S. ha establecido el modelo de MC en un país tropical (Malasia)²³, que otro ajuste para las condiciones locales y las fuentes de tejido.

Ventajas sobre métodos alternativos y actualmente establecieron modelos

En comparación con las células endoteliales de cerebro de origen bovino y roedor, pBECs proporcionan la ventaja de tener una menor tasa de pérdida del fenotipo BBB en vivo después de aislamiento²⁴. Además, son capaces de formar barreras endoteliales relativamente estrecha, aun cuando crecido en MC (Ω 800 cm²)¹⁶ en comparación con los niveles comúnmente divulgados de monocapas de líneas celulares bEND.5 y bEND.3 (Ω 50 cm²) pBECs ^{25 , 26 , 27},^29,de^28,30de cfin (300-800 Ω cm²) y cerebEND (Ω 500 cm²)^29,31,32y primario del cerebro células endoteliales del ratón (100-300 Ω cm²)SS = “xref” > 33^,34,35,36 y rata (100-300 Ω cm²)^37,38. Sin embargo, el TEER ha demostrado dependencia sobre los procedimientos de purificación y de la cultura. En la mayoría de los casos, la adición de ACM o cocultivo con astrocitos muestra efectos diferenciales sobre las células endoteliales y un aumento en tensión de las capas endoteliales¹. Sin embargo, con los esfuerzos para optimizar las condiciones de cultivo, sólo los modelos basados en bovinos han demostrado valores TEER comparable a los modelos basados en porcino (promedios de 800 Ω cm² en MC, hasta 2500 Ω cm² en co-cultivo astrositos)^{13 ,39,40,41,42,43,44,45}. Como los modelos basados en cerebro bovino primario células endoteliales han demostrado grandes variaciones, tanto entre como dentro de laboratorios^{14,45,46,47,48}, reproducibilidad podría ser un problema. En el modelo de pBEC divulgado aquí, los laboratorios que han logrado TEER muy similar y los valores de permeabilidad paracelular con baja variabilidad, tanto en como entre laboratorios. Por lo tanto, debería ser posible para otros laboratorios establecer un modelo robusto con baja variabilidad utilizando el método presentado aquí. Además formando capas endoteliales apretadas, modelos con pBECs previamente han sido validados por expresión de proteínas de Unión estrecha, funcionales transportadores BBB, receptores y enzimas y demostrada idoneidad para una amplia gama de estudios^{15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. por otra parte, datos inéditos del transcriptoma en co-cultivos de pBECs muestran un perfil esperado de BBB transportadores y receptores (resultados no publicados, Nielsen et al.).

El modelo BBB de porcino tiene otra ventaja como el genoma, la anatomía, la fisiología, y progresión de la enfermedad del cerdo reflejan la biología humana a un grado más alto que otros modelos establecidos cuenta con⁶⁰, que son favorables para la industria farmacéutica. Como cerebros porcinos son un subproducto común de la industria cárnica, constituyen una fuente fácilmente accesible de cerebro las células endoteliales, minimizando la cantidad de animales necesarios para los experimentos así proporcionando un rendimiento de alta purificación de un cerebro porcino. Aunque la purificación y cultivo de células primarias es algo lentos y requiere de conocimientos de normalización en la creación del modelo, células primarias generan los modelos más confiables de BBB. Líneas celulares inmortalizadas no pueden ser un sustituto, como características importantes tales como tirantez barrera, perfiles de expresión del transportador y microambiente regulación no reflejan los resultados experimentales en vivo^{61, 62}. in vitro modelos proporcionan la ventaja de células vivas imágenes con mayor resolución, posibilitando la visualización de procesos intracelulares permitiendo un enfoque de cercanía a las células muestreados u observados, con objetivos con la ampliación más alta y mejor calidad óptica⁶³. No es el caso para el uso de la microscopía de dos fotones en animales vivos. Además, en vitro modelos ofrecen la posibilidad de transfectar las células, permitiendo la visualización de proteínas etiquetadas e investigación de su tráfico.

Aplicaciones del modelo

La función de la BBB no es fijo y puede ser modulada dinámicamente en fisiología y patología. En muchas enfermedades neurológicas, incluyendo neurodegenerativas, enfermedades inflamatorias e infecciosas, desorganización y aumento de la permeabilidad de la BBB se observa^64,65,66,67 . Con el fin de reducir y prevenir la progresión de la enfermedad y el daño subsiguiente, identificación y caracterización de los mecanismos moleculares subyacentes a la modulación de la BBB son de gran importancia. En este contexto, confiable en vitro modelos están en alta demanda por la industria farmacéutica y además desempeñan un papel importante en la predicción de la permeabilidad BBB de fármacos al SNC. Cualquier modelo en vitro que sirve como pantalla de permeabilidad debe mostrar una vía paracelular restrictiva, una arquitectura celular fisiológico realista y expresión funcional del transportador mecanismos⁶⁸. Demostrado en anteriores estudios^16,17,57y por la permeabilidad paracelular y expresión de proteínas TJ y AJ aquí, el modelo presentado cumple todos estos criterios y es conveniente para una gama de BBB estudios en ambos fisiología normal y patología. Las fortalezas del método de purificación y cultivo presentado incluyen una combinación de simplicidad y reproducibilidad y la habilidad de incluir astrocytic influencia con un robusto y confiable alta TEER en vitro BBB modelo resultante. Para este propósito, los astrocitos de porcino y rata origen han demostrado aumentar el fenotipo BBB de pBECs en un de manera similar²².

Protocol

cerebro porcino fueron obtenido como subproductos de la industria de alimentos danesa. Los mataderos daneses están bajo estricta supervisión y observación por el Ministerio danés de medio ambiente y alimentos. utilizado para el aislamiento de astrocitos de rata fueron criado y grupo ubicado en el centro local de animal a una temperatura ambiente de 22 ° C – 23 ° C y un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h bajo inspección del veterinario y de acuerdo a danés regulaciones para animales de…

Representative Results

Establecimiento de los modelos In Vitro de BBB En el método presentado, optimizado, cultivo de pBECs y el establecimiento del sistema de inserción de membrana permeable con MC o sin ACM o NCC con astrocitos (figura 1) se llevó a cabo durante un período de 9-11 días (figura 2). Para la selección de las células endoteliales, una cultura inicial de fragmentos …

Discussion

Purificación y proliferación de pBEC

Durante el procedimiento de purificación, pasos críticos incluyen eliminación rápida y eficaz de meninges y separación de la materia blanca y gris, que es importante para el rendimiento de la purificación y la pureza y el establecimiento adecuado del modelo. El presentado en vitro BBB modelo con pBECs, hemos mejorado y simplificado de un procedimiento de purificación basado en homogeneización mecánica de materia gris aislada, tamaño select…

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc