G2-seq : Une haut débit basée sur le séquençage Technique d’identification tard reproduisant des régions du génome
Summary
Nous décrivons une technique permettant de combiner la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit pour identifier des régions fin de réplication du génome.
Abstract
Nombreuses techniques ont été développées pour suivre la progression de la réplication de l’ADN par l’intermédiaire de la phase S du cycle cellulaire. La plupart de ces techniques ont été dirigée vers l’élucidation de l’emplacement et le calendrier d’ouverture de la duplication du génome, et non son achèvement. Toutefois, il est essentiel que nous comprenons des régions du génome qui sont les dernières à terminer la réplication, car ces régions souffrent de taux élevés de cassures chromosomiques et de mutation, et ils ont été associés à la maladie et le vieillissement. Ici, nous décrivons comment nous avons étendu une technique qui a été utilisée pour surveiller l’initiation de la réplication pour plutôt identifier ces régions du génome modifié de réplication complet. Cette approche repose sur une combinaison de cytométrie en flux et séquençage à haut débit. Bien que ce rapport se concentre sur l’application de cette technique à la levure, l’approche peut être utilisée avec toutes les cellules qui peuvent être triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN.
Introduction
Réplication du génome des eucaryotes est initiée à de nombreux endroits discrets, appelés origines de réplication, de laquelle la réplication fourchettes procéder dans les deux sens (examinées par Fragkos et al., 20151). Origines varient dans leur calendrier et l’efficacité de la mise à feu, et plusieurs techniques ont été développées pour surveiller l’activité d’origine de réplication et d’élucider les causes de cette variation. L’activité d’origine individuelle peut être déduite des niveaux de simple brin ADN2, qui se forme autour des origines actives, ou en utilisant l’électrophorèse sur gel 2D pour surveiller la réplication spécifiques intermédiaires3, qui peuvent être détectés avec sondes radioactives. Ces deux techniques sont plus facilement appliquées chez S. cerevisiae que dans les cellules de mammifères, parce que les origines sont limitées à des séquences spécifiques connues dans l’ancien. Avec l’avènement des puces à ADN, il est devenu possible d’évaluer l’origine de tir dans le monde. Tout d’abord, cela a été fait par marquage ADN avec des isotopes lourds, libérant des cellules d’un bloc G1 dans isotopes légers contenant moyens et ensuite suivi la formation de lourd-léger hybride ADN dans le génome de4. L’introduction du séquençage à haut débit a permis semblable pangénomique suivi d’activité d’origine sans l’obligation de marquage isotopique coûteux. Les cellules ont été triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN et leur ADN soumis au séquençage en profondeur. Parce que la couverture de la séquence procède de 1 x à 2 x au cours de la phase S, synchronisation de réplication relative peut être évaluée en comparant les profondeurs lire des cellules en phase S à celles de G1 ou G2,5,6. Ces techniques, en particulier appliqués à la levure, a conduit à une meilleure compréhension de comment les séquence d’ADN, structure de la chromatine et protéines de réplication de l’ADN réglementent l’efficacité et le calendrier d’origine.
La transmission fidèle de l’information génétique au cours de la prolifération cellulaire ne nécessite pas seulement réussie initiation de la réplication de l’ADN, qui se déroule aux origines, mais aussi la réussite de la réplication, ce qui se produit où se rencontrent les fourches de réplication. Comme l’initiation de la réplication, le calendrier d’achèvement de la réplication varie au sein du génome avec certaines régions restantes non répliquées, même tard dans le cycle cellulaire. Ces régions peuvent être particulièrement éloignées des origines de réplication active ou peuvent contenir des séquences ou des structures de la chromatine qui entravent les ADN polymérases. Réplication tardif des régions peut se manifester comme des sites fragiles, qui sont associés à des cassures chromosomiques et des taux de mutation plus élevés et ont été impliqués dans le cancer et le vieillissement7,8,9. Toutefois, malgré l’importance du bon achèvement de la réplication de l’ADN dans le maintien de la stabilité du génome, de comprendre où et comment cela se déroule traîne loin derrière celle de l’initiation de la réplication. Et tandis que des gènes individuels dont la réplication tardive a été associée à la maladie ont été étudiées avec, par exemple, qPCR10, études mondiales visant à élucider les emplacements et les causes de retard font défaut, la réplication sous-jacentes. Ici, nous décrivons une technique nous parler pour comme « G2 seq » dans lequel nous combinons la cytométrie en flux avec le séquençage à haut débit pour faire la lumière sur l’achèvement de la réplication du génome dans11de levure. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être adapté à toutes les cellules qui peuvent être à débit-triés selon la teneur en ADN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que cette technique est robuste et relativement simple, une attention particulière devrait être consacrée à ce qui suit :
(1) nous recommandons que les cultures poussent pendant au moins 12 h avant qu’ils atteignent la phase logarithmique, puisque les différences manifestent dans les distributions de cycle cellulaire si les cultures sont récoltés après avoir atteint la densité souhaitée juste 4 h après l’inoculation. Notre hypothèse est qu’une distribution de cycle cell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par grant GM117446 NIH à A.B.
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
References
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
