Et robust protokol til at overvåge neurale populationer af time-lapse video-mikroskopi efterfulgt af software-baserede efterbehandling er beskrevet. Denne metode repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at identificere biologiske hændelser i en valgte befolkning under live imaging eksperimenter.
Forstå de mekanismer, der styrer vigtige biologiske hændelser af neurale cellepopulationer, såsom spredning og differentiering eller celle skæbne beslutninger, vil være afgørende for design terapeutiske strategier for mange sygdomme, der påvirker nervesystemet. Nuværende metoder til at spore cellepopulationer stole på deres endelige resultater i stillbilleder og de generelt undlader at levere tilstrækkeligt tidsmæssige opløsning til at identificere adfærdsmæssige funktioner i enkelte celler. Derudover variationer i celledød, adfærdsmæssige heterogenitet i en celle population, fortynding, spredning eller den lave effektivitet af de markører, der anvendes til at analysere celler er alle vigtige handicap, der vil føre til ufuldstændig eller ukorrekt udlæsning af resultaterne. Derimod repræsenterer udfører live imaging og enkelt celle sporing under passende betingelser et kraftfuldt værktøj til at overvåge hver enkelt af disse begivenheder. Her, er en time-lapse video-mikroskopi protokol, efterfulgt af efterbehandling, beskrevet til at spore neurale populationer med enkelt celle opløsning, beskæftiger specifik software. De beskrevne metoder sætte forskerne til at løse afgørende spørgsmål vedrørende celle biologi og afstamning progression af særskilte neurale populationer.
For at udvikle nye og mere effektive terapeutiske strategier for at regenerere neurale befolkninger, må vi først forstå de grundlæggende mekanismer, der opretholder celler med en regenerativ neurale potentiale. At forfølge dette mål kræver en omfattende viden om de faktorer, der regulerer ligevægten mellem ubevægelighed, spredning/differentiering, mode og timing af division, celle cyklus længde, vandrende kapacitet, levedygtighed, osv. Selv om det er en teknisk tilgang, der har været ansat i mange år1, live imaging og direkte observation er stadig den bedste mulighed for at overvåge de begivenheder, der er anført ovenfor. I modsætning til mange andre tilgange centreret om end-point udlæsninger, live imaging og enkelt celle sporing giver oplysninger i hele længden af et eksperiment2,3,4,5, 6. dermed, tilsætning af tidsmæssige opløsning tillader celledød, heterogene celle adfærd eller celle skæbne beslutninger, samt mange andre kritiske begivenheder kan identificeres, der måske ellers passere ubemærket. Ideelt set bør disse funktioner i celler bedst overvåges på en enkelt celle niveau in vivo hvor begge iboende (celle autonome) og ydre (celle niche) stikord tages i betragtning.
Men selv i i vitro situation hændelser indtræffer i et miljø, der ikke reproducere det naturlige miljø, low-density dyrkningsbetingelserne typisk anvendes i disse protokoller er mere egnet til at afsløre iboende egenskaber af den celler. Desuden kan en mere forenklet kontrol af det omgivende miljø, ved at blot ændre vækstmediet, udgøre et værdifuldt redskab til at undersøge de enkelte rolle hver ydre faktor, der definerer de neurale niche, såvel som miljømæssige faktorer, der kan induceres i patologisk scenarier7,8,9,10,11,12,13. Derfor, når korrekt konfigureret, som i den protokol, der er foreslået her, live imaging giver en realistisk in vitro- løsning for at løse de fleste af de spørgsmål, som tidligere nævnt.
Kort sagt, beskriver denne protokol hardwaren, software, dyrkningsbetingelserne og de vigtigste trin, der kræves for at fuldføre en live imaging eksperiment efterfulgt af enkelt celle tracking. Denne tilgang giver værdifulde oplysninger, som hjælper til at afsløre grundlæggende aspekter af biologi, og lineage progression af flere neurale populationer.
En af de vigtigste værdier af live imaging er mulighed for at udføre præcise afstamning sporingen, belyse kritiske aspekter af lineage progression i en neurale befolkning. Afstamning sporingen defineres som identifikation og overvågning af alle afkom af en enkelt stamfader, fra grundlæggeren af klon til det efterfølgende klon dannet21. Bemærkelsesværdigt, alternative metoder for lineage sporing (fx, viral transduktion eller flerfarvet reporter konstruktioner21) har en afgørende ulempe, hvorved det endelige resultat er baseret på still-billeder og det gør ikke nødvendigvis udgør hele sekvensen. Dette betyder at celledød, heterogenitet i opførsel af cellen befolkningen, fortynding, spredes eller dårlig effektivitet af markørerne, sammen med andre vigtige ulemper, føre til ufuldstændig eller ukorrekt udlæsning af resultater2. Desuden live imaging gør det muligt for forskeren at analysere vigtige funktioner over biologi af neurale befolkningsgrupper, såsom mode og timing af celledeling, cellevækst, migration, spredning versus differentiering, celle cyklus længde, neurite dannelse, kompleksitet og længde, celle skæbne udvalg (differentiering) eller omstilling (omprogrammering).
Desuden live imaging nemt kan suppleres med andre analyse til formål at indhente data fra enkelte celler, for eksempel, RNA sekvensering. Men for at opnå samlede udbytte fra både live imaging og andre teknikker kræver at disse celler tidligere overvåges i film er senere igen identificeret og individuelt indsamlet til sekundær analyse. Dette kan opnås ved hjælp af mikroskoper, der omfatter positionelle koordinater, ved at anvende fluorescerende journalister for bestemte celler eller analysere fordeling af grupper af celler som referencer. Ja, kombinationen af transkriptom profil og opførsel af individuelle celler kan repræsentere en kraftfuld rute at belyse ny Molekylær stikord involveret i biologi af celler.
Et af de vigtigste problemer, der kan kompromittere en live imaging eksperiment er en utilstrækkelig celle kultur tæthed. Som anført tidligere, med høj tæthed kan overskydende snavs eller dårlig dissociation (klump dannelse) påvirke kvaliteten og rumlige opløsning af billeder, gør enkelt celle tracking uigennemførlige. Betingelserne i de forskellige cellepopulationer under undersøgelse bør derfor, justeres til det laveste antal celler muligt uden at kompromittere cellekultur levedygtighed.
Hyppigheden af image erhvervelse er også af afgørende betydning og bør tilpasses omhyggeligt, især når fluorescens belysning bruges. Over-eksponering for overføres og især fluorescens lys kan kompromittere cellernes levedygtighed. Alternativt, en overdreven forsinkelse mellem erobringen af billederne kan interferere med den tidsmæssige opløsning af analysen.
En anden kritisk trin under live imaging eksperimentet er periodisk justering af fokus. Svigt i den korrekte indstilling/re-setting af brændvidden kan hindre enkelt celle tracking. Derudover er det nødvendigt nøje at kontrollere at inkubation kammer bevarer den tilstrækkelige temperatur, luftfugtighed og CO2 niveauer, ændring af uønskede variationer, der kan fremkalde celledød.
Endelig når PICC har udført, er det vigtigt at ordentligt hente xyz nul holdning forud for den sidste runde af image erhvervelse. Forkert igen indstilling af xyz nul holdning vil gøre det vanskeligt at matche de fase-kontrast og immunfluorescens billeder, hindrer identifikation af den celle afkom.
Selv om denne tilgang har mange positive aspekter, eksisterer nogle begrænsninger for den live imaging af neurale befolkninger stadig. For eksempel, gør lav celle tæthed kræves for at udføre vellykkede enkelt celle sporing af aNSCs det umuligt at anvende biokemiske assays, såsom Western blotting14. Derudover overvågning hurtigt dividere befolkninger som cerebellare astrocytter eller N2a celler er tidsmæssigt begrænset, da det ofte er for svært at spore celler som kulturer nær sammenløb. Desuden, mange kultur metoder samt de iboende biologiske begrænsninger forbundet med isolering af cellerne, ofte kompromis cellernes levedygtighed over lange perioder, begrænse varigheden af de live imaging eksperimenter. Endelig, isolere celler fra deres naturlige miljø har både positive og negative effekter. Celler isoleret fra deres fysiologiske niche kan undlade at modtage vigtige signaler, modulere deres adfærd, mens på samme tid, det repræsenterer et stærkt middel til at teste effekten af disse signaler individuelt i lineage progression af specifikke neurale populationer.
I betragtning af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, er det klart, at den perfekte metodologiske scenario ville være at udføre live imaging og enkelt celle tracking eksperimenter under normale fysiologiske forhold in vivo. Aktuelle teknikker er dog ude af stand til at følge enkelt celler i lange perioder i dyb regioner af hjernen2. Derfor, live imaging fremtid bør fokusere på at overvinde denne begrænsning, satsning hen til fuldt analysere cellebiologi af enkelt celler i vivo med de mest mindre interferens mulige fysiologiske miljø3.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Beatriz Gascon for hendes hjælp og kunst arbejde i figur 1. Vi takker også Dr. C. Norris for hans bistand. Arbejde præsenteres her blev støttet af forskningsbevillinger, “røde de excelencia Consolider-Ingenio spansk Ion kanal initiativ” (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/is-2958), UCM-Santander (PR26/16-18B-3) og Fundación Ramon Areces Grant program (PR2018/16-02). Felipe Ortega anerkender Ramon y Cajal Program spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne (MEC: RYC-2013-13290).
Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
24 wells plate | Falcon | 352047 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |