In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей
Summary
Mitophagy, процесс очистки повреждения митохондрий, необходимых для митохондриального гомеостаза и медицинского обслуживания. В статье представлены некоторые из последних mitophagy методы обнаружения в клетки человека и Caenorhabditis elegans, мышей.
Abstract
Митохондрии тяжеловесы клеток и клеточной энергии в виде АТФ. Митохондриальной дисфункции способствует биологическое старение и широкий спектр расстройств, включая метаболических заболеваний, синдромы преждевременного старения и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD) и болезнь Паркинсона (PD). Поддержание митохондриального здоровья зависит митохондриальной биогенеза и эффективное разминирование неблагополучных митохондрий через mitophagy. Экспериментальные методы для точного обнаружения autophagy/mitophagy, особенно в животных моделях, была сложной для разработки. Недавний прогресс в направлении понимание молекулярных механизмов mitophagy дало возможность разработки методов обнаружения Роман mitophagy. Здесь мы представляем несколько универсальных методов для мониторинга mitophagy в клетках человека, Caenorhabditis elegans (например, Розелла и DCT-1 / LGG 1 штаммы) и мышей (mt-Keima). Сочетание этих методов обнаружения mitophagy, включая кросс видов оценки, повысить точность измерений mitophagy и привести к глубокому пониманию роли mitophagy в здоровье и болезни.
Introduction
Mitophagy имеет важное значение для митохондриального обслуживания. Митохондрии пересекаются несколько клеток, сигнальные пути и являются универсальные субклеточном органеллы, ответственных за производство клеточной энергии, клеточный метаболизм и кальция гомеостаза1,2,3, 4. митохондрии постоянно испытывают проблемы от эндогенных и экзогенных источников, таких как реактивнооксигенных видов (ров) и митохондриальной токсикантов, соответственно, которые приводят к генерации «возрасте» и неблагополучных митохондрий. Накопление повреждения митохондрий снижает эффективность производства АТФ, увеличивая количество вредных рос и был связан с возрастных заболеваний, таких как метаболические заболевания, AD и PD1,5,6 . Чтобы предотвратить митохондрии индуцированных клеточных дисфункции, клетки необходимость конкретно признать повреждение митохондрий и эффективно удалить их через сотовый процесс называют митохондриальной autophagy (mitophagy). Это продемонстрировало важность mitophagy в области здравоохранения и болезни иллюстрирует необходимость точных и эффективных методов для обнаружения mitophagy в пробирке и в естественных условиях.
Mitophagy является многоступенчатого процесса с участием многих белков и белковых комплексов5,,78. Короче говоря повреждения митохондрий впервые признается и обхватил двойной membraned phagophore, которое может быть взято из плазматической мембраны, эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, ядро или митохондрий, сам9,10. Сферический phagophore удлиняется и в конечном итоге уплотнения митохондрии внутри, составляющие митохондриальной autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome затем предохранители с Лизосома деградации, образуя autolysosome, в котором повреждения митохондрий это деградированных и переработанных в7,8. Основные autophagic белки, также участвующих в mitophagy включают в себя: Autophagy связанных 7 (ATG7) и Beclin1 (начало), белок Microtubule-Associated 1A/1B-свет цепь 3 (LC3-II) (LGG-1 C. Элs) и p62 (компонент phagophore), и связанные лизосомальных мембран гликопротеина 2 (LAMP2)6,7. Кроме того есть несколько основных белков, уникальные для mitophagy, включая PTEN-индуцированной Putative киназы 1 (PINK-1), Parkin1, ядерных белков Dot 52 кДа (NDP52), optineurin, BCL2 взаимодействия протеина 3 как (NIX/BNIP3L) (DCT-1 в C. elegans), среди других5,6,11.
Распространенным методом для выявления изменений в уровнях autophagy является соотношение LC3-II/LC3-я или LC3-II/актина. Однако этот метод является неспецифической, как увеличение этого показателя может отражать увеличение посвящения или нарушением синтеза mitophagosome Лизосома12. Другой метод заключается в оценке colocalization между autophagy маркера (например, LC3) и митохондриальных белок (например, ацилкарнитин из внешних митохондриальной мембраны 20 (TOMM20, который может снизиться протеосомы)). Однако, это может только указать изменения в уровнях общего mitophagy и не может отличить шаги в которых блокировка происходит. Это можно уточнить с помощью лизосомальных ингибиторы (например, A E64d + Pepstatin, называется EP) параллельно вызывают накопление mitophagosomes. Разница между количество mitophagosomes на базовом и количество mitophagosomes, после лечения с EP можно указать mitophagy. Эти ограничения побудили разработка методов обнаружения Роман mitophagy. С учетом растущей актуальности mitophagy в широком спектре заболеваний человека мы представляем несколько методов обнаружения надежные mitophagy, которые могут быть полезны для исследователей. Мы охватывают как in vitro и in vivo методы и рекомендуем совместить несколько методов для проверки изменений mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Точное измерение mitophagy является технически сложным. Здесь мы представили несколько надежных методов, которые позволяют для обоих качественного обнаружения mitophagy и количественной оценки уровня mitophagy в наиболее распространенных лабораторных экспериментальных моделей.
Д…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Ацуши Miyawaki и д-р Ричард Дж. Юль для совместного использования МТ Keima плазмиды и МТ Keima интегрированы НеЬа клетки. Мы благодарим Елена а. Shamanna и д-р Дебора л Крото за критическое прочтение рукописи. Это исследование было поддержано очной программы исследований NIH (VAB), Национальный институт по проблемам старения, а также 2014-2015 и 2016-2017 Ниа интра Лаборатория Грант (EFF, VAB). EFF поддержал RHF SOR-Ост ХЕЛЬЗЕ (проект No: 2017056) и научно-исследовательский совет Норвегии (проект No: 262175).
АВТОР ВЗНОСЫ:
EFF предназначена рукописи и подготовила проект; КП, NS, EMF, RDS, ОАО, SAC, YH и Эд писал различные разделы документа; NT, JP, HN и VAB пересмотренный рукописи и опыта.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
