Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.
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Article de méthode
In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les mitochondries sont les puissances des cellules et produisent de l’énergie cellulaire sous forme d’ATP. Dysfonctionnement mitochondrial contribue au vieillissement biologique et une grande variété de troubles y compris les maladies métaboliques, maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP) et les syndromes de vieillissement prématuré. Maintien d’une santé mitochondriale dépend de la biogenèse mitochondriale et le déminage efficace de dysfonctionnels mitochondries par l’intermédiaire de mitophagy. Des méthodes expérimentales pour détecter avec précision l’autophagie/mitophagy, en particulier dans des modèles animaux, ont été difficiles à développer. Les progrès récents vers la compréhension des mécanismes moléculaires de mitophagy a permis le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Ici, nous présentons plusieurs techniques polyvalents pour surveiller les mitophagy dans les cellules humaines, Caenorhabditis elegans (p. ex., Rosella et souches DCT-1 / LGG-1) et les souris (mt-Keima). Une combinaison de ces techniques de détection de mitophagy, y compris l’évaluation interspécifique, améliorera la précision des mesures mitophagy et conduire à une meilleure compréhension du rôle de mitophagy dans la santé et la maladie.
Introduction
Mitophagy est essentiel pour fonctionnement mitochondrial. Les mitochondries croisent de multiples voies de signalisation de cellulaire et sont des organites subcellulaires universels responsables de la production d’énergie cellulaire et métabolisme cellulaire calcium homeostasis1,2,3, 4. mitochondries constamment expérience défis provenant de sources endogènes et exogènes, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et substances toxiques mitochondriales, respectivement, qui conduisent à la génération des « âgés » et dysfonctionnels m....
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Protocole
Animaux (souris mâles et femelles) est nés et élevés dans une animalerie accrédité, conformément et approbation de la Commission de l’emploi et de NIH animalier. Méthodes d’euthanasie doivent être conformes à toutes les réglementations nationales et institutionnelles.
1. détection de Mitophagy dans les cellules humaines
- Détection de mitophagy à l’aide de plasmide mt-Keima
Remarque : La protéine Keima, fusionnée à un signal de cible des mitochondries, simplifié en mt-Keima, s’est avérée utile pour la détection in vivo mitophagy. MT-Keima est une protéine fluorescente ratiométrique sensibles au pH, qui p....
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Résultats
Détection des Mitophagy dans les cellules humaines :
À l’aide de la procédure présentée ici, l’humains cellules HeLa ont été transfectées avec mt-Keima plasmide. Cellules saines ont démontré un réseau bien organisé mitochondrial (GFP, 488 nm) avec une incidence peu de mitophagy (DP, 561 nm). Cependant, les cellules prétraitées avec un découpleur mitochondrial FCCP (30 µM pour 3 h) présentaient une augmentation profonde incidence mi.......
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Discussion
Une mesure précise de mitophagy est techniquement difficile. Ici, nous présentons plusieurs techniques robustes qui permettent les deux détection qualitative des mitophagy et quantification des niveaux mitophagy dans les modèles expérimentaux de laboratoire courantes.
Acquisition de données réplicables, un modèle expérimental au moins trois répétitions biologiques est nécessaire. Tous les chercheurs impliqués dans l’expérimentation et l’analyse doivent être aveugle aux identités de groupe expé.......
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Déclarations de divulgation
Le laboratoire de Bohr a CRADA accords avec ChromaDex et GlaxoSmithKline.
Remerciements
Nous remercions m. Atsushi Miyawaki et Dr. Richard J. Youle partage le plasmide Keima-mt et mt-Keima intégré les cellules Hela. Nous remercions Raghavendra A. Shamanna et Dr. Deborah L. Croteau de la lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de la NIH (VAB), l’Institut National sur le vieillissement, mais aussi un 2014-2015 et 2016-2017 NIA intra-laboratoire accordent (FEP, VAB). EFF a été pris en charge par HELSE DORS-OST RHF (projet No : 2017056) et le Conseil norvégien de la recherche (projet No : 262175).
CONTRIBUTIONS DE L’AUTEUR :
EFF conçu le manus....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| souris mt-Keima | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 réactif de transfection d’ADN | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | milieu sans sérum |
| mtKemia plasmide : pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| Anticorps COXII (souris) | abcam | #ab110258 | |
| Anticorps LAMP2 (lapin) | NOVUS | ||
| chèvre-anti-lapin avec longueur d’onde 568 nm de protéine fluorescente rouge (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | colorant Alexa Fluor 568 |
| chèvre-anti-souris avec longueur d’onde 488 nm de protéine fluorescente verte (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 |
| prolonge l’anti-décoloration dorée avec DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| Plaque 6 puits | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| Lame à 4 puits | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F Plaque 96 puits | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B anticorps de lapin | NOVUS | #NB100-2220 | |
| Anticorps ADN | Progen Biotechnik | #anti-DNA souris monoclonale, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | milieu de montage anti-évanouissement avec DAPI |
| IN Analyseur de cellules (lecteur fluorescent | GE Healthcare Life Sciences | #IN Analyseur de cellules 2200 | |
| Eclipse TE-2000e Microscope confocal | Nikon | #TE-2000e | |
| Logiciel de colocalisation | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Logiciel Zeiss ZEN 2012 |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| milieu de culture cellulaire | Thermofisher | #DMEM&ndash ; Dulbecco’s Modified Eagle Medium | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Sérum de veau fœtal | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Incubateur de culture cellulaire | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 Incubateur | |
| Microscope à épifluorescence | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| appareil photo | Olympus | Olympus DP71 | |
| microscope confocal | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| logiciel confocal | Zeiss | ZEN 2012 | |
| d’images | Image J | analyse de colocalisation, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| logiciel d’analyse statistique | GraphPad Software Inc., San Diego, États-Unis | GraphPad Prism progiciel | |
| matériel pour fabriquer un pic à vis sans fin | Surepure Chemetals | #4655 | Le pic est fait de fil de fer de calibre 30 90 % platine 10 % iridium |
| IR : N2 ; Ex[pmyo-3 TOMM-20 ::Rosella] | Demande matérielle à Tavernarakis Nektarios | Maintenir les animaux transgéniques à 20 ° ; C | |
| IR : N2 ; Ex[pdct-1 DCT-1 ::GFP ; pmyo-3 DsRed ::LGG-1] | Enquête matérielle à Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20 ::Rosella | Enquête matérielle à Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1 ::GFP | Enquête matérielle à Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed :: LGG-1 | Enquête matérielle à la solution de paraquat Tavernarakis Nektarios | ||
| voir données supplémentaires pour la préparation | |||
| Tampon M9 | voir données supplémentaires pour la préparation | ||
| Tampon M9-lévamisole | voir données supplémentaires pour la préparation | ||
| Lames de microscope en verre et lamelles | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Pince chirurgicale | STERIS Animal Health | 19 pièces Canine Spay Pack Economy | |
| Ciseaux chirurgicaux | STERIS Animal Health | 19 pièces Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS doit être dilué à 1x PBS à l’aide d’un agitateur ddH2O |
| Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package Un | |
| tampon d’agarose à 2 %, | voir les données supplémentaires pour la préparation | ||
| Lames Vibroslice | World precision instruments | #BLADES-2 | lame unique |
| à tranchant MSC | #78803988 | 0,012 po d’épaisseur x 6 po de largeur x 12 po de longueur, tôle d’acier inoxydable 430 | |
| Triton X-100 | détergent | ||
| Dichlorure de méthyl viologène hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubateur pour nématodes | AQUALYTIC | Incubateur pour maintenir 20 ° ; C | |
| Stéréomicroscope à dissection | Olympus | SMZ645 | |
| Microscope confocal | Zeiss | AxioObserver Z1 | Pour nématodes (étape 2) |
| microscope à épifluorescence | Zeiss | AxioImager Z2 | Pour nématodes (étape 2) |
| Réticulant UV | Vilber Lourmat | BIO-LINK &ndash ; Source de lumière UV BLX-E365 | ; 356 nm |
Références
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
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Réimpressions et autorisations
