Targeting dei tioli cisteina per in Vitro site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti
Summary
Le analisi biochimiche e strutturali delle proteine glicosilate richiedono relativamente grandi quantità di campioni omogenei. Qui, presentiamo un efficiente metodo chimico per site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti purificate da batteri prendendo di mira i tioli reattivi di Cys.
Abstract
Stromal interazione molecola-1 (STIM1) è un tipo-io la proteina del transmembrane situato sul reticolo endoplasmatico (ER) e membrane plasmatiche (PM). ER-residente STIM1 regola l’attività dei canali PM Orai1 in un processo noto come memorizzare voce azionata calcio (Ca2 +) che è il principale Ca2 + segnalazione processo che spinge il sistema immunitario. STIM1 subisce post-traduzionali N– glicosilazione in due siti di Asn luminal all’interno del Ca2 + rilevamento dominio della molecola. Tuttavia, la biochimica, biofisica, e gli effetti biologici di struttura di N– glicosilata STIM1 erano capiti male fino a recentemente dovuto un’incapacità di facilmente ottenere alti livelli di omogeneo N– glicosilata proteina. Qui, descriviamo l’implementazione di un in vitro approccio chimico che attribuisce moiety glucosio ai siti di proteina specifica applicabili alla comprensione degli effetti sottostanti di N– glicosilazione il meccanismo e la struttura della proteina. Usando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare soluzione valutiamo sia l’efficienza della modificazione nonché le conseguenze strutturali del collegamento del glucosio con un singolo campione. Questo approccio può essere adattato facilmente per studiare le proteine glicosilate una miriade che si trovano in natura.
Introduction
Negozio gestito calcio (Ca2 +) voce (SOCE) è la via principale, in cui le cellule immunitarie prendono il Ca2 + dallo spazio extracellulare nel cytosol. Nei linfociti T, cellule T recettori situati sulla membrana plasmatica (PM) legano gli antigeni che attivano proteine tirosin chinasi (rivisto in 1,2,3). Una cascata di fosforilazione conduce all’attivazione di fosfolipasi-γ (PLCγ), che successivamente ha trasmesso l’idrolisi di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) in diacilglicerolo e inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3 ). IP3 è un piccolo messaggero diffusibile che si lega ai IP3 recettori (IP3R) il reticolo endoplasmatico (ER) quindi aprire questo canale del ricevitore e permettendo Ca2 + a fluire verso il basso la pendenza di concentrazione dall’ER lumen al cytosol (rivisto in 4). Segnalazione da accoppiati a proteine G e recettori tirosina-chinasi in una varietà di altre cellule eccitabili e non eccitabili tipi piombo per la produzione stessa di IP3 e l’attivazione di IP3Rs del ricevitore.
A causa del Ca2 + deposito capacità limitata dell’ER, IP3-rilascio mediato e aumento risultante in Ca citosolico2 + è solo temporaneo; Tuttavia, questo svuotamento del ER luminal Ca2 + effetti profondamente stromal interazione molecola-1 (STIM1), un tipo-io transmembrana (TM) proteina trovata principalmente sul ER membrana 5,6,7. STIM1 contiene un lume-oriented Ca2 + rilevamento dominio costituito da una coppia di EF-hand e sterile di α-motivo (EFSAM). Tre citosolico orientato arrotolato-arrotola domini sono separati da EFSAM dal singolo dominio TM (rivisto in 8). Al momento di svuotamento2 + ER luminal Ca, EFSAM subisce una destabilizzazione-accoppiato oligomerizzazione 7,9 che provoca riarrangiamenti strutturali della TM e arrotolato-arrotola domini 10. Questi cambiamenti strutturali culminano in un intrappolamento di STIM1 ER-PM giunzioni 11,12,13,14 attraverso interazioni con PM phosphoinositides 15, 16 e Orai1 subunità 17,18. Orai1 proteine sono le subunità di PM che assemblano per formare Ca2 + canali 19,20,21,22. Facilitano le interazioni di STIM1-Orai1 alle giunzioni di ER-PM una Ca2 + sblocco attivato Ca2 + (CRAC) canale conformazione aperta che consente lo spostamento di Ca2 + nel citosol da alte concentrazioni della spazio extracellulare. In cellule del sistema immunitario, il citosolico Ca2 + elevazioni continue attraverso canali di CRAC inducono il Ca2 +– calmodulina/calcineurina dipendente defosforilazione del fattore nucleare delle cellule di T attivate che successivamente entra nel nucleo e inizia la regolazione trascrizionale di geni promuovendo l’attivazione delle cellule T 1,3. Il processo di attivazione del canale CRAC di STIM1 23,24 via indotta da agonisti ER luminal Ca2 + lo svuotamento e la risultante citosolico Ca2 + elevazione continua è collettivamente denominato SOCE 25. Il ruolo vitale dei SOCE in cellule di T è evidente da studi che dimostrano che le mutazioni ereditabili in Orai1 e STIM1 possono causare immunodeficienza combinata grave sindromi 3,19,26, 27. EFSAM avvia SOCE dopo rilevamento luminal ER Ca2 + svuotamento tramite la perdita di Ca2 + coordinamento presso la canonica EF-hand, infine conducendo alla destabilizzazione-accoppiato autoassociazione 7, 28,29.
La glicosilazione è il legame covalente ed elaborazione di strutture oligosaccaride, noto anche come glicani, attraverso vari passaggi biosintetici in ER e Golgi (rivisto in 30,32,33). Ci sono due tipi predominanti di glicosilazione negli eucarioti: N-collegati e O-collegato, a seconda delle specifiche dell’aminoacido e atomo colmare il sollevatore. In N– glicosilazione, glicani sono associati l’ammide di catena laterale di Asn, e nella maggior parte dei casi, il passo di iniziazione si verifica nell’ER come polipeptide catena si muove nel lume 34. Il primo passo di N– glicosilazione è il trasferimento di una struttura di nucleo di quattordici-zucchero composto da glucosio (cromatografia gaseoliquido), mannosio (uomo) e N– acetilglucosamina (GlcNAc) (cioè Glc3Man9GlcNAc2) da un ER dei lipidi di membrana da un oligosaccharyltransferase 35,36. Ulteriori passi, come la scissione o il trasferimento di residui di glucosio, vengono catalizzate al pronto soccorso di glicosiltrasferasi e specifiche glicosidasi. Alcune proteine che lasciano l’ER e spostare nel Golgi possono essere ulteriormente trasformati 37. O– glycosylation si riferisce all’aggiunta di glicani, solitamente per il gruppo dell’idrossile di catena laterale dei residui Ser o Thr, e questa modificazione avviene interamente nel complesso di Golgi 33,34. Ci sono diverse strutture di – glycan Oche possono essere costituiti da N– acetilglucosamina, fucosio, galattosio e acido sialico con ogni monosaccaride aggiunto in sequenza 33.
Mentre nessuna sequenza specifica è stata identificata come prerequisito per molti tipi di O– glicosilazione, una sequenza di consenso comune è stata associata con la N-collegato modifica: Asn-X-Ser/Thr/Cys, dove X può essere qualsiasi amminoacido tranne Pro 33. STIM1 EFSAM contiene due di questi siti di consenso N– glicosilazione: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che la EFSAM può essere N– glicosilata in cellule di mammifero in Asn131 e Asn171 38,39,40,41. Tuttavia, gli studi precedenti delle conseguenze di N– glicosilazione su SOCE sono state incongruenti, suggerendo soppresso, ha rafforzato o alcun effetto di questa modifica alberino-translational su SOCE attivazione 38,= “xrif” > 39,40,41. Così, la ricerca sulle conseguenze biofisiche, biochimiche e strutturali sottostanti di EFSAM N– glicosilazione è fondamentale per comprendere gli effetti normativi di questa modifica. A causa del requisito per alti livelli di proteine omogenei in questi esperimenti in vitro , è stato applicato un approccio selettivo sito cui connettersi covalentemente moiety glucosio EFSAM. Interessante, Asn131 e Asn171 glicosilazione causato cambiamenti strutturali che convergono all’interno del nucleo EFSAM e che permettono di migliorare le proprietà biofisiche che promuovono STIM1-mediata SOCE 42.
L’allegato chimica dei gruppi glicosilici Cys tioli è stata consolidata da un lavoro seminale che in primo luogo ha dimostrato l’utilità di questo enzima-libero approccio alla comprensione degli effetti specifici del sito di glicosilazione su proteina funzione 43 , 44. più recentemente e per quanto riguarda STIM1, i residui Asn131 e Asn171 erano mutati di Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] è stato usato per covalenza collegarsi glucosio i tioli liberi 42. Qui, Descriviamo questo approccio che non solo utilizza mutagenesi per incorporare i residui di Cys specifici sito per la modifica, ma si applica anche la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) soluzione per valutare rapidamente strutturale ed efficienza di modifica perturbazioni a causa la glicosilazione. In particolare, questa metodologia generale è facilmente adattabile per studiare gli effetti di entrambi O– o N– glicosilazione di qualsiasi recombinantly prodotto della proteina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glicosilazione della proteina è una modificazione post-traduzionale dove gli zuccheri sono covalente di polipeptidi principalmente attraverso collegamenti con catene laterali dell’amminoacido. Oltre il 50% delle proteine di mammiferi sono glicosilata 54, dove le proteine glicosilate successivamente possono avere una vasta gamma di effetti da alterazione biomolecolare affinità di legame, che influenzano la proteina pieghevole, alterando l’attività del canale, il targeting molecole per degradazio…
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalle scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (05239 di P.B.S), Fondazione canadese per l’innovazione/Ontario Research Fund (per P.B.S), Prostate Cancer Foundation combattere – Telus Ride per papà (di P.B.S) e Ontario Borsa di studio laureato (per Y.J.C. e N.S.).
Materials
| Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
| Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
| DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
| Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
| BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
| DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
| 0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
| HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
| 3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
| 5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
| Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
| Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
| HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
| AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
| 600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |
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