इस प्रोटोकॉल के विकास का वर्णन करता है एक इन विट्रो osteoclastogenesis के परिधीय रक्त monocytes से मानव नैदानिक मॉडल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के साथ संस्कृति के कैंसर कोशिका-अस्थिशोषक बातचीत की नकल करने के लिए । मॉडल हड्डी मेटास्टेसिस गठन के बारे में हमारी समझ और चिकित्सकीय विकल्प में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अस्थि microenvironment में ट्यूमर कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच crosstalk हड्डी मेटास्टेसिस गठन के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक सह के स्तन कैंसर की कोशिकाओं की संस्कृति और osteoclasts की ओर भेदभाव के दौर से गुजर monocytes के एक इन विट्रो पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल विकसित की है । हम osteoclastogenesis के एक मॉडल परिधीय रक्त स्वस्थ दाताओं से एकत्र का एक नमूना से शुरू अनुकूलित । परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) पहले घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा अलग किया गया, एक उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त और दो विकास कारकों (GFs) जोड़कर अंतर करने के लिए प्रेरित: परमाणु कारक के रिसेप्टर उत्प्रेरक-κB ligand (RANKL) और macrophage कॉलनी-उत्तेजक भाज्या (MCSF). कोशिकाओं 14 दिनों के लिए संस्कृति में छोड़ दिया और फिर तय की और बहाव विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया । osteolytic बोन मेटास्टेसिस, अस्थि में कैंसर कोशिका आगमन के प्रभाव में से एक osteoclastogenesis की प्रेरण है । हम इस प्रकार सह स्तन कैंसर की कोशिकाओं की संस्कृतियों के साथ हमारे मॉडल को चुनौती के लिए GFs के संबंध में कैंसर कोशिकाओं के भेदभाव शक्ति का अध्ययन । कैंसर कोशिका-अस्थिशोषक बातचीत के अध्ययन का एक सीधा रास्ता स्तन कैंसर कोशिका संस्कृतियों से एकत्र और ताजा माध्यम के साथ मिश्रित वातानुकूलित माध्यम के उपयोग के आधार पर अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों प्रदर्शन करने के लिए है । इस मिश्रण तो अस्थिशोषक भेदभाव प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम भी प्रत्यक्ष सह संस्कृति है जिसमें कैंसर की कोशिकाओं और monocytes भेदभाव के दौर से गुजर के एक विधि अनुकूलित मध्यम और विनिमय स्रावित कारकों । इस मूल अप्रत्यक्ष सह संस्कृति पद्धति पर एक महत्वपूर्ण सुधार के रूप में शोधकर्ताओं ने दो कोशिका प्रकार के पारस्परिक बातचीत का पालन कर सकते है और दोनों कैंसर कोशिकाओं और osteoclasts के लिए बहाव का विश्लेषण करते हैं । इस विधि हमें मेटास्टेटिक हड्डी microenvironment पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और बीज कोशिका लाइनों स्तन कैंसर से प्राप्त उन के अलावा अंय करने के लिए सक्षम बनाता है । मॉडल में ऑस्टियोपोरोसिस या अन्य हड्डियों की स्थिति जैसे अन्य रोगों का भी अध्ययन किया जा सकता है ।
अस्थि प्रोस्टेट, फेफड़े और स्तन कैंसर के रूप में प्राथमिक ट्यूमर के विभिंन प्रकार के लिए मेटास्टेसिस का एक आम साइट है, रोग के पाठ्यक्रम के दौरान हड्डी मेटास्टेसिस के विकास के 20-25% केसाथ1, 2, 3 । विशेष रूप से, स्तन कैंसर रोगियों की ७०% मौत पर हड्डी मेटास्टेसिस के सबूत ले4। ट्यूमर और stromal कोशिका संपर्क दोनों प्राथमिक कैंसर और द्वितीयक घावों में कैंसर की प्रगति के लिए आवश्यक है । अस्थि microenvironment में, स्तन कैंसर से osteolytic अस्थि मेटास्टेसिस एक रोग दुष्चक्र कैंसर कोशिकाओं के बीच होने वाली चक्र की स्थापना पर निर्भर करता है, अस्थि कोशिकाओं, और हड्डी microenvironment. कैंसर कोशिकाओं हड्डी संतुलन को बाधित, बढ़ती हड्डी याला५,६,७.
सामांय और रोग की स्थिति में, osteoclasts अस्थि अवशोषण के लिए जिंमेदार कोशिकाओं रहे हैं, जबकि osteoblasts, नए मैट्रिक्स जमा करने में, नई हड्डी के गठन के लिए जिंमेदार है8। अस्थिशोषक गतिविधि RANKL की अभिव्यक्ति है, जो पूर्व अस्थिशोषक सतह पर अपनी रिसेप्टर रैंक करने के लिए बांध के माध्यम से osteoblasts द्वारा विनियमित है, पूर्व अस्थिशोषक फ्यूजन, परिपक्व osteoclasts में भेदभाव के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया उत्प्रेरण. प्रेरणे osteoclastogenesis प्रमाणात याला वृद्धि होते. वीवो स्टडीज में बड़ी संख्या में अस्थि मेटास्टेसिस गठन9,10,11की हमारी समझ में काफी सुधार हुआ है । प्राथमिक ट्यूमर और अस्थि में से स्तन कैंसर की कोशिकाओं microenvironment perturb प्रमाणात homeostasis, संवर्धन osteoclastogenesis आणि वाढ याला८. इस परिदृश्य में, सभी आणविक बातचीत है कि कैंसर की कोशिकाओं और osteoclasts के बीच घटित महत्वपूर्ण महत्व के हैं । जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, अस्थि मेटास्टेसिस गठन के तंत्र में वीवो चूहों के मॉडलों का आविर्भाव किया गया है । हालांकि, आचार समिति द्वारा vivo पशु प्रयोगों में सभी की मंजूरी की जरूरत के अलावा, उच्च लागत और समय लेने वाली विधियों सहित vivo प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए कई अन्य कमियां हैं. कई लेखकों vivo में नैदानिक संयुक्त है और इन विट्रो मॉडल osteoclastogenesis के पूर्व osteoclasts कच्चे 246.79,10,11बुलाया के एक murine लाइन का उपयोग कर । इस मॉडल की कमियां तथ्य यह है कि कोशिकाओं को पहले से ही पूर्व osteoclasts बनने के लिए प्रतिबद्ध है और मानव मूल के नहीं है से स्टेम । इन कारणों के लिए, शोधों के अनुसंधान से काफी इन विट्रो में पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल अस्थि कैंसर सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए की उपलब्धता से लाभ हो सकता है ।
हम मानव परिधीय रक्त के नमूनों12,13से शुरू इन विट्रो में osteoclastogenesis की एक विधि अनुकूलित । Osteoclasts monocytes से निकला है, जो मौजूद हैं, हालांकि एक छोटे से डिग्री करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों में. Mononuclear कोशिकाओं को पहले Ficoll घनत्व ढाल द्वारा एरिथ्रोसाइट्स और पूरे रक्त में मौजूद granulocytes से अलग कर रहे हैं; वे तो लिम्फोसाइटों के विपरीत, प्लास्टिक सब्सट्रेट करने के लिए उनका पालन करने की क्षमता के लिए धन्यवाद चुना जाता है. बोने के बाद, कोशिकाओं को 14 दिनों के लिए संस्कृति है । MCSF और RANKL monocytes द्वारा आवश्यक GFs है मैक्रोफेज में पहले अंतर और फिर osteoclasts14,15में । MCSF परख की पूरी अवधि के लिए आवश्यक है, जबकि RANKL osteoclastogenesis के देर चरणों में भेदभाव की प्रक्रिया को प्रेरित किया जाता है । भेदभाव के प्रारंभिक चरण में, MCSF monocytes पैदा में मदद करता है और14,15जीवित रहते हैं । osteoclastogenesis के दूसरे भाग के दौरान, कोशिकाओं के साथ फ्यूज और osteoclasts के रूप में परिपक्व, छल्ले में Actin एफ के लक्षण वितरण दिखा और tartrate के रूप में विशिष्ट मार्करों-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) और कैल्सीटोनिन रिसेप्टर व्यक्त सीटीआर) 14 , 15. हमारे विधि monocyte संस्कृति को MCSF जोड़ने के प्रयोग के पहले 7 दिनों के लिए और 7 से 14 दिनों से MCSF और RANKL का एक संयोजन शामिल हैं । प्रयोग के अंत में, osteoclastogenesis विभेदित कोशिकाओं की गिनती, नीचे के रूप में विस्तृत द्वारा विश्लेषण किया है ।
monocyte को GFs द्वारा अंतर करने के लिए प्रेरित संस्कृतियों हमारे नैदानिक मॉडल के आधार फार्म । हम GFs के बिना एक सह संस्कृति प्रणाली को बेहतर स्तन कैंसर की कोशिकाओं के osteoclastogenic शक्ति को समझने के लिए अनुकूलित । हम पहले एक माध्यम जोड़कर अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों के एक मॉडल विकसित (८०% α-ंयूनतम आवश्यक माध्यम (α-मेम) और 20% वातानुकूलित मध्यम स्तन कैंसर की कोशिकाओं है कि के बारे में ९०% थे अंतर के दौर से गुजर कोशिकाओं को धाराप्रवाह के एक संस्कृति से एकत्र12 . वातानुकूलित मध्यम (सीरम अभाव शर्तों के तहत एकत्र नहीं) 24 घंटे के बाद एकत्र किया गया था और 1:4 के अनुपात में ताजा माध्यम के साथ मिलाया । वातानुकूलित मध्यम नकारात्मक नियंत्रण के संबंध में महत्वपूर्ण अस्थिशोषक भेदभाव प्रेरित । हालांकि, के रूप में कैंसर की कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच पारस्परिक संपर्क पर जानकारी खो दिया है जब अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों का उपयोग कर, हम प्रत्यक्ष सह संस्कृतियों बाहर ले जाकर हमारी प्रणाली में सुधार हुआ । हम ०.४ µ मीटर आवेषण में कैंसर की कोशिकाओं को वरीयता दी और उंहें कुओं में रखा जहां mononuclear कोशिकाओं को चढ़ाया गया । इस विधि का उपयोग कर, कोशिकाओं को एक ही मध्यम और विनिमय गुप्त प्रोटीन का हिस्सा है । हम इस प्रकार कैंसर की कोशिकाओं को13से प्रेरित osteoclastogenesis के एक पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल बनाया ।
इस प्रणाली के अत्यंत बहुमुखी है और विभिंन अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे, औषधीय अध्ययन में हड्डी मेटास्टेसिस में दवाओं की भूमिका की जांच । हमारे मॉडल यह कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति में हड्डी microenvironment में हड्डी लक्षित चिकित्सा और/या अर्बुदरोधी दवाओं की प्रभावकारिता और कार्रवाई के तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव बनाता है13. सही नियंत्रण के साथ प्रयोग डिजाइनिंग, यानी, कैंसर कोशिकाओं और व्यक्तिगत रूप से संस्कृति osteoclasts, यह आसान दवा गतिविधि पर सह संस्कृति के प्रभाव को समझने के लिए बनाता है । इस दृष्टिकोण और भी दिलचस्प हो जाता है जब दवा लक्ष्य का अध्ययन किया जा रहा दोनों कैंसर कोशिकाओं और osteoclasts, जैसे, everolimus16। यह मॉडल भी कैंसर कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच बातचीत के नए रास्ते की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
मानव osteoclasts को स्वस्थ दानदाताओं के PBMCs से विभेदित किया गया जिन्होंने अध्ययन में भाग लेने के लिए लिखित सूचित सहमति दे दी. अध्ययन प्रोटोकॉल स्थानीय एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था, के अनुसार में ?…
इन विट्रो में नैदानिक मॉडल कैंसर कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच crosstalk के तंत्र का अध्ययन करने के लिए अस्थि मेटास्टेसिस के तंत्र की पहचान की जरूरत है कि नए चिकित्सीय रणनीतियों बनाने के लिए इस्तेमा?…
The authors have nothing to disclose.
हम SCP2 सेल लाइन और संपादकीय सहायता के लिए क्रिस्टियानो वेरना प्रदान करने के लिए Yibin कांग धंयवाद देना चाहूंगा ।
αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |