Udvikling af en menneskelig prækliniske Model af Osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter Co kulturperler med bryst kræft cellelinjer

Summary

Denne protokol beskriver udviklingen af en in vitro- humane prækliniske model af osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter kulturperler med bryst kræft cellelinjer til at efterligne kræft celle-osteoklast interaktion. Modellen kan bruges til at fremme vores forståelse af metastaser knogledannelse og forbedre terapeutiske muligheder.

Abstract

Krydstale mellem tumorceller og knogleceller i knoglen mikromiljø er afgørende for at forstå mekanismen af knogledannelse metastaser. Vi udviklede en in vitro- fuldt humane prækliniske model af en fælles kultur af brystkræftceller og monocytter gennemgår differentiering mod osteoklaster. Vi optimeret en model af osteoclastogenesis med udgangspunkt i en stikprøve af perifert blod indsamlet fra raske donorer. Perifert blod mononukleære celler (PBMC) først blev adskilt af tæthed gradient centrifugering, seedet på en høj densitet og tilskyndet til at differentiere ved at tilføje to vækstfaktorer (GFs): receptor aktivator af nuklear factor-κB ligand (RANKL) og makrofag koloni-stimulerende faktor (MCSF). Cellerne blev efterladt i kultur i 14 dage og derefter fastsættes og analyseret af downstream analyse. I osteolytiske knoglemetastaser er en af virkningerne af kræft celle ankomst i knoglen induktion af osteoclastogenesis. Vi udfordrede dermed vores model med co kulturer af brystkræftceller at studere kræftceller med hensyn til GFs differentiering magt. En enkel måde at studere kræft celle-osteoklast interaktion er at udføre indirekte Co kulturer baseret på brugen af aircondition medium indsamlet fra bryst kræft cellekulturer og blandet med frisk medium. Denne blanding er derefter anvendes til at fremkalde osteoklast differentiering. Vi har også optimeret en metode til direkte Co kultur i hvilke kræft celler og monocytter gennemgår differentiering del medium og udveksle udskilles faktorer. Dette er en betydelig forbedring over den oprindelige indirekte Co kultur metode som forskere kan observere de gensidige interaktioner af to celletyper og udføre downstream analyser for både kræftceller og osteoklaster. Denne metode gør det muligt for os at studere effekten af lægemidler på metastatisk knogle mikromiljø og frø cellelinjer end dem, der stammer fra brystkræft. Modellen kan også bruges til at studere andre sygdomme såsom osteoporose eller andre knogler betingelser.

Introduction

Knoglen er et fælles websted for metastaser til forskellige typer af primære tumorer såsom prostata-, lunge- og brystkræft kræft, med 20-25% af patienter, der udvikler knoglemetastaser i løbet af sygdommen^1,2,3. 70% af brystkræftpatienter bære navnlig tegn på knogle metastaser død⁴. Tumor og stromale celle interaktion er afgørende for kræft progression i både primær kræft og sekundære læsioner. I knogle mikromiljø afhænge osteolytiske knoglemetastaser fra brystkræft af oprettelsen af en patologisk ond cirkel mellem kræftceller, knogleceller og knogle mikromiljø. Kræftceller forstyrre knogle balance, øge knogle resorption^5,6,7.

Under normale og patologiske forhold er osteoklaster de celler der er ansvarlig for knogleresorption, mens osteoblaster, i deponeringen nye matrix, er ansvarlig for ny knogle dannelse⁸. Osteoklast aktivitet er reguleret af osteoblaster gennem udtryk af RANKL, som binder sig til sin receptor rang på pre osteoklast overflade, inducerende pre osteoklast fusion, en nødvendig proces for differentiering af modne osteoklaster. Induktion af osteoclastogenesis øger knogleresorption. Et stort antal i vivo undersøgelser har markant forbedret vores forståelse af knogle metastaser dannelse^9,10,11. Brystkræftceller fra den primære tumor, knoglen mikromiljø forurolige knogle homøostase, fremme osteoclastogenesis og knogle resorption⁸. I dette scenario er alle de molekylære vekselvirkninger der sker mellem kræftceller og osteoklaster af afgørende betydning. Som allerede nævnt, er mekanismen af metastaser knogledannelse klarlagt i i vivo mus modeller. Men ud over behovet for godkendelse af alle i vivo dyreforsøg ved den etiske komité, der er flere andre ulemper til at udføre i vivo forsøg herunder høje omkostninger og tidskrævende metoder. Flere forfattere har kombineret prækliniske i vivo og in vitro- modeller af osteoclastogenesis ved hjælp af en murine linje af pre osteoklaster kaldet RAW246.7^9,10,11. Ulemperne ved denne model skyldes, at cellerne er allerede forpligtet til at blive pre osteoklasterne og der ikke er af menneskelig oprindelse. Af disse grunde kunne Translationel forskning stor gavn af tilgængelighed af in vitro- fuldt humane prækliniske modeller at studere knogle kræft celle interaktioner.

Vi optimeret en metode af osteoclastogenesis in vitro- startende fra humant perifert blod prøver^12,13. Osteoklaster stammer fra monocytter, som er til stede, omend i en lille grad i perifert blodprøver. Mononukleære celler er først adskilt fra erytrocytter og granulocytter i fuldblod af Ficoll tæthed farveforløb; de er derefter valgt takket være deres evne til at overholde plastunderlag, i modsætning til lymfocytter. Efter såning, er celler dyrkes i 14 dage. MCSF og RANKL er GFs kræves af monocytter at differentiere først i makrofager og derefter ind i osteoklaster^14,15. MCSF er nødvendig for den samlede varighed af analysen, hvorimod RANKL bruges til at inducere differentiering proces i de sene stadier af osteoclastogenesis. I den tidlige fase af differentiering hjælper MCSF monocytter formere sig og overleve^14,15. Under anden del af osteoclastogenesis celler smelter sammen og modne som osteoklaster, viser den karakteristiske distribution af Actin F i ringe og udtrykke specifikke markører som tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) og calcitonin receptor (CTR) ^{14 , 15}. vores metode består i at føje MCSF til monocyt kultur for de første 7 dage for forsøget, og en kombination af MCSF og RANKL fra dage 7 til 14. I slutningen af forsøget, er osteoclastogenesis analyseret ved at tælle de differentierede celler, som beskrevet nedenfor.

Monocyt kulturer induceret differentiering af GFs danner grundlag for vores prækliniske model. Vi optimeret en fælles kultur system uden GFs til bedre at forstå osteoclastogenic effekt af brystkræftceller. Vi først udviklet en model af indirekte Co kulturer ved at tilføje et medium (80% α-Minimal afgørende Medium (α-MEM) og 20% aircondition medium indsamlet fra en kultur af brystkræftceller at var omkring 90% sammenflydende celler under differentiering¹² . Konditioneret medium (ikke indsamlet på serum afsavn betingelser) blev indsamlet efter 24 timer og blandet med frisk medium på en del af 1:4. Konditioneret medium induceret betydelig osteoklast differentiering med hensyn til den negative kontrol. Men som information om den gensidige interaktion mellem kræftceller og knogleceller går tabt, når ved hjælp af indirekte Co kulturer, vi forbedret vores system ved at gennemføre direkte Co kulturer. Vi seedede kræftceller i 0,4 µM indsætter og placeret dem i brønde hvor mononukleære celler blev forgyldt. Brug denne metode, celler deler samme medium og udveksle udskilles proteiner. Vi har således skabt et fuldt humane prækliniske model af osteoclastogenesis induceret af kræft celler¹³.

Dette system er meget alsidig og kan anvendes til forskellige formål, fxi farmakologiske undersøgelser undersøger rollen, narkotika i knogle metastaser. Vores model gør det muligt at studere den effekt og virkningsmekanisme af knogle-målrettede behandlinger og/eller antitumor narkotika i knoglen mikromiljø i overværelse af kræft celler¹³. Designe eksperimenter med den korrekte kontrol, gør dvs., kræftceller og osteoklaster kulturperler individuelt, det lettere at forstå konsekvenserne af fælles kultur på stof aktivitet. Denne fremgangsmåde bliver endnu mere interessante når stoffet undersøges mod både kræft-celler og osteoklaster, fxeverolimus-¹⁶. Denne model kan også bruges til at identificere nye veje i vekselvirkning mellem kræftceller og knogleceller.

Protocol

menneskelige osteoklaster blev differentieret fra PBMC af raske donorer, der gav skriftlig informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det lokale etiske udvalg, i overensstemmelse med de etiske normer af Helsinki-erklæringen fra 1964. 1. osteoklast differentiering Bemærk: indsamle perifert blod eller buffy frakker fra sunde menneskelige donorer i EDTA. Brug ikke mindre end 20 mL af perifert blod. Buffy frakker e…

Representative Results

En metode blev optimeret til at let skelne osteoklaster fra humant perifert blod monocytter. Monocyt kultur var kulturperler med kræftceller, bekræfter (som beskrevet i litteraturen18), at kræftceller er i stand til at opretholde osteoclastogenesis i knoglemetastaser. Osteoklaster differentieret fra kræftceller og GFs er vist i figur 1. En osteoklast-lignende celle er en celle med 4 eller flere kerner og er positive for FÆLDE farv…

Discussion

Prækliniske undersøgelser in vitro- modeller at studere mekanismerne af krydstale mellem kræftceller og knogleceller er nødvendige for at identificere mekanismer af knogle metastaser, der kan bruges til at skabe nye terapeutiske strategier. Vi udviklede en fuldt humane i vitro model af osteoclastogenesis fra humant perifert blod (figur 3). Under optimering af metoden, blev en række kritiske punkter identificeret og løst. Først angår mængden af mononukleære celler …

Materials

αMEM	Euroclone	BE12-169F
Glutamine	Life-technologies	ECB3000D
Fetal bovine serum	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	Storage indications must be respected
hRANKL	Peprotech	310-01	Storage indications must be respected
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma Aldrich	387 A
Lymphocyte separation media	Biowest	L0560-100
Red Blood cell lysing buffer	SIgma	11814389001 ROCHE
Trypsin	EuroClone	COD. ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	157-4-100
MDA-MB-231 cell line	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size