Cartographie de tout le génome de chromatine Accessible dans les Lymphocytes T humains primaires par ATAC-Seq
Summary
Dosage pour la Transposase Accessible chromatine couplé avec le séquençage haut-débit (ATAC-seq) est une méthode de Génome-large pour découvrir la chromatine accessible. Il s’agit d’un protocole étape par étape de ATAC-seq, du moléculaire à la dernière analyse computationnelle, optimisé pour les lymphocytes humains (Th1/Th2). Ce protocole peut être adopté par les chercheurs sans expérience préalable dans les méthodes de séquençage de prochaine génération.
Abstract
Dosage pour la chromatine Transposase Accessible avec le séquençage haut-débit (ATAC-seq) est une méthode utilisée pour l’identification des régions (accessibles) ouvertes de la chromatine. Ces régions représentent réglementaire des éléments d’ADN (par exemple, promoteurs, exhausteurs, locus contrôle les régions isolateurs) dont transcription facteurs se lient. Cartographie du paysage de la chromatine accessible est une approche puissante pour découvrir les éléments de régulation actives au sein du génome. Cette information sert une approche impartiale pour découvrir le réseau des facteurs de transcription pertinents et de la structure de la chromatine des mécanismes qui régissent les programmes d’expression de gène. ATAC-seq est une alternative robuste et sensible à la DNase I analyse hypersensibilité couplé avec le séquençage de prochaine génération (DNase-seq) et formaldéhyde assistée par isolement des éléments régulateurs (FAIRE-seq) pour l’analyse du génome de la chromatine l’accessibilité et à la séquence de micrococcique sites sensibles à la nucléase (MNase-seq) pour déterminer le positionnement des nucléosomes. Nous présentons un protocole détaillé de ATAC-seq optimisé immunitaire primaire humain cellules c.-à-d. CD4 + lymphocytes (T helper 1 (Th1) et les cellules Th2). Ce protocole complète commence par la récolte de cellules, puis décrit la méthode moléculaire de la chromatine tagmentation, préparation des échantillons pour le séquençage de prochaine génération et inclut également des méthodes et considérations pour les analyses de calculs utilisés pour interpréter les résultats. De plus, pour gagner du temps et argent, nous avons introduit des mesures de contrôle de qualité afin d’évaluer la bibliothèque ATAC-seq avant séquençage. Ce qui est important, les principes présentés dans le présent protocole permettent son adaptation à d’autres cellules primaires humaines immunitaires et non immuns et les lignées cellulaires. Ces lignes directrices sera également utiles pour les laboratoires qui ne maîtrisent pas avec les méthodes de séquençage de prochaine génération.
Introduction
ATAC-seq1,2 est une méthode robuste qui permet l’identification des régions de chromatine ouverte réglementaire3 et positionnement des nucléosomes. Cette information est appliquée pour inférer l’emplacement, identité et l’activité de facteurs de transcription. Sensibilité de la méthode pour mesurer les variations quantitatives dans la structure de la chromatine permet l’étude de l’activité des facteurs de la chromatine, y compris des rénovateurs de la chromatine et modificateurs, ainsi que l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase II1. ATAC-seq fournit donc une approche puissante et impartiale pour décrypter les mécanismes qui régissent la régulation transcriptionnelle dans n’importe quel type de cellules d’intérêt. Nous décrivons l’adaptation de l’ATAC-seq aux cellules humaines primaires de Th1 et Th2.
ATAC-seq, hyperactif Tn5 transposase chargé avec adaptateurs pour la nouvelle génération de séquençage (NGS) couples fragmentation de l’ADN avec marquage de l’ADN avec adaptateurs (c’est-à-dire, le processus de « tagmentation »)1. Après amplification par PCR, les bibliothèques d’ADN qui en résultent sont prêts pour l’ordonnancement de prochaine génération (Figure 1). La tagmentation préférentielle de chromatine accessible est détectée par l’analyse d’un enrichissement local de lectures de séquençage ATAC-seq.
L’exigence pour moins produit de départ, par rapport à d’autres méthodes pour mesurer l’accessibilité de la chromatine et positionnement nucléosomique comme DNase-seq4, FAIRE-seq5et6de MNase-seq et une courte procédure expérimentale a encouragé l’utilisation du ATAC-seq dans les systèmes biologiques multiples, y compris les cellules humaines primaires1,7 et échantillons cliniques8, ainsi que des organismes unicellulaires-9plantes10, drosophiles11 et divers mammifères12.
L’identité de la transcription des facteurs qui sont liés au locus accessibles peuvent être découvert par analyse de l’enrichissement de leurs motifs de séquences de liaison ou alliant ATAC-seq immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie par haut débit (de séquençage de l’ADN ChIP-seq). Cette approche a permis l’identification des facteurs de transcription spécifiques lignée importantes pour l’hématopoïèse dans la souris13. La nature globale et impartiale de l’ATAC-seq permet d’étudier la régulation génique dans les organismes pour lesquels les réactifs tels que les anticorps pour l’analyse de la puce ne sont pas disponibles. Par exemple, les variations évolutives cis-régions régulatrices ont été identifiés par l’étude des cellules de la crête neurale crânienne du14les humains et les chimpanzés, variations de développement dans les éléments de régulation au cours de la souris au début l’embryogenèse15, changements dans le paysage réglementaire pendant un cycle de vie des unicellulaires owzarzaki c.9et l’évolution des promoteurs et des amplificateurs à travers 20 mammifère espèces12.
ATAC-seq a également joué un rôle important pour mesurer l’accessibilité de la chromatine dans des cellules individuelles, donc révélateur variabilité au sein de populations de cellules, qui habituellement se soustrait pangénomique études7,16. En outre, ATAC-seq peut servir à étudier les changements qui se produisent dans les régions régulatrices de l’ADN dans des conditions de la maladie, dans lequel les échantillons sont rares. Par exemple, ATAC-seq peut être utilisé pour étudier les changements dans le paysage réglementaire lors de l’apparition de la leucémie myéloïde aiguë (AML)17 ou Ras-driven oncogenèse11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de ATAC-seq décrit ici a été avec succès employé pour l’analyse de la chromatine accessible dans les cellules primaires (humain Th1, Th2 cellules et B) ainsi que les lignées de cellules cultivées (MCF10A humain cellules cancéreuses et les cellules de glioblastome U261). Application de ATAC-seq aux autres types de cellules peut-être exiger certains optimisation de protocoles, en particulier dans l’étape de lyse. Si la concentration de détergent non ionique est trop élevée, il peut y avoir un …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la Fondation des sciences Israël (subvention 748/14), Marie Curie intégration accorder (CIG) – pcrd7-personnes-20013-CIG-618763 et j’ai-CORE programme et de la planification et budgétisation Comité The Israel Science Foundation grant no 41/11.
Materials
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
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IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
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IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
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