Påvisande av mitokondrier membranet Potential att studera CLIC4 Knockdown-inducerad HN4 Cell apoptos In Vitro
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för tillämpning av rodamin 123 att identifiera den mitokondriella membranpotentialen (MMP) och studera CLIC4 knockdown-inducerad HN4 cell apoptos in vitro. Under gemensamma fluorescens Mikroskop och confocal laser scanning fluorescens Mikroskop spelades realtid ändringen av MMP.
Abstract
Utarmning av den mitokondriella membranpotentialen (MMP, ΔΨm) anses vara den tidigaste händelsen i apoptotiska kaskad. Det förekommer även inför nukleära apoptotiska egenskaper, inbegripet kromatin kondens och DNA skador. När de MMP kollapsar, cell apoptos inleda irreversibelt. En serie av lipofila katjoniska färgämnen kan passera cellmembranet och aggregera inne i matrisen av mitokondrie, och fungera som fluorescens markör att utvärdera MMP förändring. Som en av de sex medlemmarna i Cl– intracellulära kanal (CLIC) Familj, deltar CLIC4 i cellen apoptotiska processen främst via mitokondriell vägen. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta MMP via övervakning av fluorescens fluktuationer i rodamin 123 (Rh123), genom vilken vi studerar apoptos induceras av CLIC4 knockdown. Vi diskutera fördelar och begränsningar av tillämpningen av confocal laserscanning och normala fluorescens Mikroskop i detalj, och även jämföra det med andra metoder.
Introduction
Rh123 är ett katjonaktiva fluorescens färgämne, som fungerar som en indikator för transmembrana potential. Rh123 kan penetrera cellmembranet och ange matrisen mitokondriell beroende på potentiella skillnaden av inom och utanför membranet1. Apoptos leder till skador på mitokondriella membranet integritet. Mitokondrien permeabilitet övergången pore (MPTP) öppnas och leda till kollaps av den MMP, vilket i sin tur resulterar i utsläpp av Rh123 på utsidan av mitokondrierna. Slutligen kommer starkare grön fluorescens signal detekteras under fluorescens Mikroskop. Det är väl dokumenterat att utarmning av MMP och förhöjda membran permeabilitet är tidiga tecken på cell apoptos2. Rh123 kan därför tillämpas på detektion av MMP förändring och förekomst av cell apoptos.
Som den 6: e vanligaste carcinom i världen försämras huvud och hals cancer allvarligt en persons hälsa3. Även om många metoder har utvecklats under de senaste åren, är kliniskt utfall av behandlingen för patienter som lider av huvud och hals skivepitelcancer (SCHH) fortfarande inte perfekt4. Utforska nya terapeutiska metoder kan förbättra behandlingen för SCHH5. Jonkanaler som involverar många biologiska processer visar en viktig roll i utvecklingen av olika cancerformer6. Helt eller delvis deltagande av Cl– kanaler är mycket engagerade i olika egenskaper av neoplastiska omvandling, inklusive aktiv migrering, hög spridning och invasivitet. Mot bakgrund av detta, har CLIC, en roman protein familj, listats som en lovande klass av terapeutiska mål för cancer behandling6,7. Senare studier visat att CLIC familjemedlemmar inklusive CLIC1, CLIC4 och CLIC5, lokalisera till hjärt mitokondrie och reaktivt syre artnivå (ROS) är uppreglerad av CLIC5, som anger den funktionella rollen för mitokondrie-ligger Cl – kanaler i apoptotiska svar8. CLIC4, en medlemmar av familjen CLIC (även känd som mtCLIC, P64H1 och RS43), har studerats mest för dess apoptotiska förordning boenden i cancerceller och subcellulär läge inklusive Golgi, endoplasmatiska retiklet och mitokondrier i mänskliga keratinocyter7,9,10. Uttryck profil CLIC4 reglerades av tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), P53 och yttre stimulans. Överuttryck och nedreglering av CLIC4 utlösa en apoptotiska svar främst via mitokondriell vägen tillsammans med obalansen av Bcl-2 familjemedlemmar, aktivering av kaspas cascade, och frisättning av cytokrom C11, 12 , 13. därför MMP mätning är avgörande för att utforska CLIC4-relaterade apoptos och Rh123 fungerar som en idealisk fluorescens indikator.
Föreliggande studie beskriver ett detaljerat protokoll för detektion av MMP att studera CLIC4 knockdown-inducerad apoptos i HN4 celler. Rh123 används som en fluorescens sond för att Observera ändringen av MMP. Under gemensamma fluorescens Mikroskop och confocal laser scanning fluorescens Mikroskop, kan realtid fluktuationer i MMP lösas. Vi diskutera fördelar och begränsningar av tillämpningen av confocal laserscanning fluorescens Mikroskop i detalj, och även jämföra det med andra metoder. Detta protokoll kan också tillämpas på andra apoptos-relaterade studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är väl dokumenterat att Cl− kanaler är nödvändigt att upprätthålla hemostas av den interna miljön och spelar viktiga roller i cellproliferation och apoptos15,16. Förstå sambandet mellan ion kanal-riktad intervention och apoptos är därför i stort behov och betydelse för att hitta en bättre behandlingsmetoder för olika cancerformer17. Mitokondrier bibehålla normala biologiska statusen för en cell och dess f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vänligen tacka Mr Chao Fang för cellodling. Detta arbete stöds av bidrag från naturvetenskap Foundation i Kina (Grant nr 81570403, 81371284); Anhui provinsiella naturvetenskap Foundation (Grant No. 1408085MH158); Framstående unga forskare Anhui Medical University; Stödja Program för utmärkt unga talanger i universiteten i Anhui-provinsen.
Materials
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow… applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
