In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide
Summary
We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.
Abstract
Beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) zijn rijpe leukocyten, die een essentiële fysiologische rol als professionele fagocyten staat van clearing een scala aan deeltjes te dienen. Normaal BMDMs zijn beperkt van het centrale zenuwstelsel (CNS), maar na een blessure, ze gemakkelijk kunnen infiltreren. Eenmaal binnen de gewonde weefsel van de CNS, BMDMs zijn de primaire celtype verantwoordelijk voor de goedkeuring van letsel-afgeleide cellulaire puin, met inbegrip van grote hoeveelheden van lipide-rijke myeline puin. De neuropathologische vertakkingen van BMDM infiltratie en myeline puin fagocytose binnen de CNS zijn complex en niet goed begrepen. De protocollen die hier beschreven, toestaan voor de studie direct in vitro van BMDMs in het kader van CNS letsel. We dekken lymfkliertest BMDM isolatie en cultuur, myeline puin voorbereiding en testen om te beoordelen BMDM myeline puin fagocytose. Deze technieken robuuste kwantificeerbare resultaten zonder de noodzaak van aanzienlijke gespecialiseerde apparatuur of materialen, maar kunnen gemakkelijk worden aangepast aan de behoeften van onderzoekers.
Introduction
Beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) zijn een belangrijke schakel tussen de aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Als antigeen presentatie van cellen (APCs), ze kunnen communiceren met lymfocyten via beide antigeen presentatie en cytokine release1,2,3. Echter als professionele fagocyten is hun primaire functie om ziekteverwekkers, leeftijd cellen, en cellulaire puin1,4te ontruimen. Na een dwarslaesie (SCI), aanzienlijke hoeveelheden van myeline puin is gegenereerd op basis van stervende oligodendrocyten, het celtype verantwoordelijk voor CNS axon myelinisering5. Wij en anderen hebben aangetoond dat Goedkeuringvande myeline puin primair de verantwoordelijkheid is van het BMDMs5,6,7te infiltreren. Echter binnen dwarslaesie is sites engulfment van myeline puin gesuggereerd deze normaal anti-inflammatoire cellen naar een pro-inflammatoire staat5,8,9moeten worden verschoven. Als belangrijkste bemiddelaars van neuro-ontsteking in het ruggenmerg gewonde zijn BMDMs belangrijke klinische doelstellingen.
Om te helpen onderzoeken van de invloed van BMDMs in het gewonde ruggenmerg, hebben we een in vitro model direct bestuderen hoe BMDMs reageren op myeline puin. Ter verbetering van biologische relevantie, worden zowel primaire lymfkliertest BMDMs en vers geïsoleerde myeline puin gebruikt in deze onderzoeken. Als zodanig, de methoden die hier gepresenteerd detail ook de isolatie en de cultuur van primaire lymfkliertest BMDMs, en een gemodificeerde sacharose kleurovergang techniek die gebruikt wordt om te isoleren lymfkliertest CNS afgeleid myeline puin10,11,12. Myeline puin kan gemakkelijk worden aangeduid met een fluorescente kleurstof, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), te volgen die de internalisering door BMDMs. CFSE is geschikt voor deze toepassing omdat het niet-cytotoxische, en de smalle fluorescerende spectrum vergunningen multiplexing met andere tl sondes13,14. Na fagocytose, myeline puin lipiden zijn de lysosomen vervoerd en verpakt als neutrale lipiden in intracellulaire lipide druppels5. Om te kwantificeren deze intracellulaire lipide-accumulatie, presenteren we een olie Red O (ORO) kleuring van de methode die is geoptimaliseerd voor kwantitatieve beeldanalyse. Deze eenvoudige kleuringstechniek produceert robuuste reproduceerbare resultaten en kwantificering15. Deze methoden vergemakkelijken de studie van myeline puin fagocytose en lipide retentie met beperkte gespecialiseerde apparatuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven procedures gebruiken zowel vers geïsoleerde ruwe CNS myeline puin en primaire beenmerg-afgeleide macrofagen. Verklein dierlijke uitgaven en raden we beide hersenen en beenmergcellen worden geoogst uit elke muis op het moment van offer. Twee onderzoekers samen te werken kunnen gelijktijdig beide materialen voorbereiden. U kunt ook kunnen hersenen worden opgeslagen bij-80 ° C in PBS aangevuld met antibiotica voorafgaand aan myeline puin isolatie. Het is onze ervaring dat de hersenen in deze voorwaarden…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist bij de FSU College of Medicine voor al zijn werk in videoproductie, bewerken en voice-over.
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01GM100474 en R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
- Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
- Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
- Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
- Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
- Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
- Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
- Larocca, J. N., Norton, W. T. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
- Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
- Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
- Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
- Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
- Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
- Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
- Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
