폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항
Summary
이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.
Abstract
폐 전이 분석 결과 (푸 마) 이며 폐 explant 비보 전 폐쇄 셀 문화 시스템 형광 현미경 검사 법에 의해 폐 식민 osteosarcoma (OS)에서 생물학을 공부 하는 연구원입니다. 이 문서는 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 전이성 성장 widefield 또는 공초점 형광 현미경 플랫폼을 사용 하 여 이미지 데이터를 얻는 예에 설명 합니다. 푸 마 모델의 유연성 허용 연구원 폐 microenvironment에서 운영 체제 셀의 성장 뿐만 아니라 공부 뿐만 아니라 시간이 지남에 안티 전이성 치료제의 효과 평가 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 폐 실질과 OS 세포 상호 작용의 전례 없는, 고해상도 이미징에 대 한 수 있습니다. 또한, 푸 마 모델은 형광 염료 나 형광 단백질 유전자 기자와 함께, 연구팀은 폐 microenvironment, 세포 및 subcellular 구조, 유전자 기능 및 전이성 OS 셀에 발기인 활동 공부할 수 있습니다. 푸 마 모델 다리 연구자 새로운 전이 생물학 발견 하 고 새로운 안티 전이성, 타겟 요법의 활동을 평가에 대 한 새로운 도구를 제공 합니다.
Introduction
전이성 osteosarcoma (OS)와 소아 환자에 대 한 향상 된 결과 여전히 중요 한 충족된 임상 필요 1남아 있습니다. 이 새로운 분자로-타겟 요법 개발의 중요성을 밑줄. 대상 종양 세포 증식 하지 전이성 질병, 그리고 이렇게 새로운 전략을 치료에 효과가 입증 된 기존의 chemotherapeutics 2전이성 과정 자체를 타겟으로 해야 합니다. 현재 문서에서는 상대적으로 새로운 유형의 비보 전 폐 전이 모델, 폐 전이 분석 결과 (푸 마) 멘도사와 동료3, 새로운 발견에 유용한 도구를 제공 하 여 개발의 실용적인 측면을 설명 합니다. OS 4,5에서 폐 전이 진행에서 분자 드라이버. 그러나 계속 하기 전에, 그것은 간단히, 전이의 몇 가지 현재 모델에 따라 터치 것 하 고 어떻게 푸 마 모델은 기존의 시험관에 비해 여러 이점을 제공 분석 실험.
전이 공부 하는 데 사용 하는 가장 실험적인 모델 특정 단계 또는 전이성 캐스케이드의 여러 단계를 정리 하는 생체 외에서 그리고 vivo에서 시스템의 구성. 이러한 단계를 포함: 1) 종양 세포 주변 혈관 (혈액 또는 임 파 액) 및 교통 순환, 내 기본 종양, 2) intravasation에서 마이그레이션 3) 보조 사이트, 4) 넘쳐 흐름 및 보조 사이트, 5) 형성에 생존에서 체포 micrometastases, 및 6)의 vascularized 전이 (그림 1)로 성장. 전이의 생체 외에서 모델 2 차원 (2D) 마이그레이션을 포함할 수 있으며 3 차원 (3D) Matrigel 침공 분석 실험에서 검토는 자세히 다른 곳 6. Vivo에서 모델에 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되 모델 시스템 포함: 1) 자발적 전이 모델 은 종양 세포가 저절로 전이성 세포 나 지방 종양을 형성 하는 특정 조직 유형으로 주입 하는 orthotopically 먼 사이트; 2) 실험 전이 모델 은 종양 세포는 혈관 상류의 대상 기관에 주사 된다. 예를 들어 한 꼬리 정 맥 주입의 종양 세포 개발 폐 전이5,,78. 다른 실험적인 전이 모델 비장 또는 간 전이9,10의 개발에 결과 mesenteric 정 맥으로 종양 세포의 주입을 포함 됩니다. 이러한 비보에 모델의 실용적인 고려 사항 웰 치 11자세히 설명 되어 있습니다. 또 다른 vivo 모델 소아 sarcomas에 전이 공부 하는 데 사용 로컬 종양 형성 및 자연 스러운 전이 폐 12,13에 귀착되는 신장 신장 subcapsular 종양 이식 모델이입니다. Intravital videomicroscopy 수 같은 더 기술적으로 까다로운 기술을 직접 시각화에 전이성 암 세포와 전이성 사이트의 microvasculature 간의 실시간, 상호 작용 (예. 폐 또는 간) 맥도날드14에 의해 설명 된 대로 및 Entenberg15또는 김 16에 의해 설명 된 대로 chorioallantoic 막에 암 셀 넘쳐 흐름.
푸 마 모델은 폐 조직 explant 비보, ex , 닫힌된 문화 시스템 어디 형광 종양 세포의 성장을 관찰 될 수 있다 경도 형광 현미경 검사 법을 통해 한 달의 기간 동안 ( 그림 2A참조). 이 모델이 전이성 캐스케이드에서 폐 식민 (3 ~ 5 단계)의 초기 단계. 기존의 체 외에 모델을 통해 푸 마 모델의 주요 장점은: 1)에 경도 측정 폐 microenvironment 의 많은 기능을 유지 하는 3D microenvironment에 전이성 암 세포 성장 하는 기회 제공 vivo 3; 2) 푸 마 수 후보 유전자 또는 약물 치료의 최저 3D 폐 microenvironment;의 맥락에서 안티 전이성 활동을가지고 있는지를 평가 하는 연구원 3) 푸 마 모델은 유연한 형광 현미경 검사 법 (그림 2B)와 같은 플랫폼 widefield 형광 현미경 검사 법 또는 레이저 스캔 confocal 현미경 검사 법의 많은 유형으로, 각각의 예제 그림 2C & D에 표시 됩니다. 각각. 이 문서는 푸 마 모델의 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 전이성 성장에 경도 이미징 데이터를 얻기 위해 사용 하는 방법을 설명 합니다-표현, 인간의 높고 낮은 전이성 다리 셀 (MNNG와 호 셀, 각각)를 사용 하 여 낮은 확대 widefield의 형광 형광 성 염료는 폐 실질, 레이블 및 레이블 운영 체제에서 미토 콘 드리 아 유전자 기자 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 사용 하는 푸 마 모델에 셀 레드-형광 단백질 이미징의 예 또한 토론 된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음 기술 문서에서는 운영 체제에서 폐 식민지 공부에서 푸 마 모델의 몇 가지 실용적인 측면을 설명 합니다. 어디 연구 해야 합니다 여분의 처리 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계는 다음과 같습니다.
a) cannulation 기도 의입니다. 기도 주변 근육 및 결합 조직 해 부 동안 쉽게 손상 될 수 있습니다. 또한, 카 테 터의 바늘 기도 통해 쉽게 밀어 수 있습니다. 바늘의 경사는 캐 뉼 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 박사 Arnulfo 멘도사 푸 마 기술에서 훈련을 제공 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는이 연구의 과정에서 그들의 현미경의 사용을 제공 하기 위한 박사 Chand Khanna, 수잔이 필드 (NCI/NIH), 그리고 샘 Aparicio (기원전 암 기구)를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 소아 종양학 분기 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 (부분적으로) 지원 되었다. M.M.L.는 국립 연구소 건강 교내 방문 동료 프로그램의 (수상 15335)에 의해 지원 되었다 그리고 현재 전이 연구에서 조 앤 파커 친교에 의해 지원 됩니다. P.H.S.는 브리티시 컬럼비아 암 재단에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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