Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires
Summary
L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).
Abstract
L’essai de métastase pulmonaire (PuMA) est une ex vivo explant de poumon et le système de culture de cellules fermées qui permet aux chercheurs d’étudier la biologie de la colonisation de poumon dans l’ostéosarcome (OS) par microscopie à fluorescence. Cet article fournit une description détaillée du protocole et traite des exemples d’obtenir des données d’image sur la croissance métastatique à l’aide de widefield ou plateformes de microscopie confocal fluorescence. La souplesse du modèle PuMA permet des chercheurs d’étudier non seulement la croissance des cellules d’OS dans le microenvironnement de poumon, mais aussi pour évaluer les effets de la thérapeutique anti-métastatique au fil du temps. La microscopie confocale permet l’imagerie haute résolution, sans précédent des interactions cellulaires OS avec le parenchyme pulmonaire. En outre, le modèle PuMA est associé à des colorants fluorescents ou reporters génétique de la protéine fluorescente, les chercheurs peuvent étudier le microenvironnement de poumon, les structures cellulaires et subcellulaires, la fonction du gène et l’activité de promoteur dans les cellules d’OS métastatiques. Le modèle PuMA offre un nouvel outil pour les chercheurs d’ostéosarcome à découvrir la nouvelle biologie de métastase et évaluer l’activité de nouveaux traitements anti-métastatiques et ciblées.
Introduction
Amélioration des résultats pour les patients pédiatriques atteints d’ostéosarcome métastatique (OS) reste encore une critique comblés clinique 1. Cela souligne l’importance de développer des nouvelles thérapies moléculaires ciblées. Des agents chimiothérapeutiques classiques que la prolifération des cellules tumorales cible n’ont pas été prouvées pour être efficace dans le traitement de la maladie métastatique et donc de nouvelles stratégies doivent cibler le processus métastatique lui-même 2. L’actuel article porte sur les aspects pratiques d’un type relativement nouveau de ex vivo le modèle métastase pulmonaire, le dosage de métastase pulmonaire (PuMA) développé par Mendoza et ses collègues3, qui fournit un outil utile pour découvrir de nouveaux conducteurs moléculaires dans la progression de métastases pulmonaires en OS 4,5. Toutefois, avant de poursuivre, il serait prudent d’aborder brièvement plusieurs modèles actuels de métastases et comment le modèle PuMA offre plusieurs avantages sur conventionnelles in vitro tests.
Des modèles plus expérimentaux utilisés pour étudier les métastases comprennent des systèmes in vitro et in vivo de récapitulent une étape spécifique ou plusieurs étapes de la cascade métastatique. Ces étapes incluent : émigrer loin de la tumeur primitive, l’intravasation 2) dans des navires voisins (sanguin ou lymphatique) et transport en commun au sein de la circulation, des cellules de tumeur 1) 3) arrêter au site secondaire, extravasation 4) et la survie du site secondaire, formation de 5) des micrométastases et 6) la croissance des métastases vascularisés (Figure 1). Les modèles in vitro de la métastase peuvent inclure 2 dimensions migration (2D) et 3 Dimensions (3D) analyses d’invasion Matrigel qui sont examinés en détaillent ailleurs 6. Pour les modèles in vivo , les deux systèmes de modèles couramment utilisés comprennent : 1) le modèle de métastase spontanée est où des cellules tumorales sont orthotopically injecté dans un type spécifique de tissu pour former une tumeur locale qui apporte spontanément des cellules métastatiques à des endroits éloignés ; 2) le modèle expérimental de métastase est où les cellules tumorales sont injectés dans le vaisseaux sanguins en amont de l’organe cible. Par exemple, une queue injection dans la veine des résultats de cellules de tumeur dans le développement du poumon métastases5,7,8. Autres modèles expérimentaux métastase comprennent l’injection de cellules tumorales dans la rate ou de la veine mésentérique qui se traduit par le développement des métastases hépatiques9,10. Des considérations pratiques de ces modèles in vivo sont examinées en détail par Welch 11. Un autre modèle in vivo utilisé pour étudier des métastases dans les sarcomes pédiatriques est le modèle d’implantation sous-capsulaire tumeur rénale rein qui provoque la formation de tumeurs locales et métastase spontanée aux poumons 12,13. Une technique plus techniquement exigeante comme vidéomicroscopie intravitale peut visualiser directement, en temps réel, interactions entre les cellules de cancer métastatique et la microcirculation d’un site métastatique (ie. poumon ou du foie) tel que décrit par MacDonald14 et Entenberg,15, ou cancer cell extravasation dans la membrane chorio-tel que décrit par Kim, 16.
Le modèle de PuMA est une ex vivo, l’explant tissu pulmonaire, système de culture fermée où la croissance des cellules tumorales fluorescent peut être longitudinalement observée par microscopie de fluorescence au cours d’une période d’un mois (voir la Figure 2 a). Ce modèle récapitule les étapes initiales de la colonisation de poumon (étapes 3 à 5) dans la cascade métastatique. Quelques grands avantages du modèle PuMA par rapport aux modèles classiques in vitro sont : 1) elle offre la possibilité de mesurer la croissance des cellules cancéreuses métastatiques dans un micro-environnement 3D qui conserve de nombreuses caractéristiques du microenvironnement poumon longitudinalement dans vivo 3; 2) puMA permet au chercheur de déterminer si la précipitation d’un traitement de gène ou médicament candidat a une activité anti-métastatique dans le contexte d’un micro-environnement poumon 3D ; 3) le modèle PuMA est souple avec une multitude de plateformes de microscopie de fluorescence (Figure 2 b) comme la microscopie de fluorescence widefield ou microscopie confocale à balayage laser, des exemples de chacun sont montrés dans la Figure 2 -D, respectivement. Cet article discute comment utiliser le modèle PuMA pour obtenir des données d’imagerie longitudinales sur la croissance métastatique de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP)-exprimer, les cellules humaines ostéosarcome métastatique haute et basse (MNNG et HOS cellules, respectivement) à l’aide faible grossissement widefield fluorescence. Exemples d’imagerie un colorant fluorescent qui étiquète le parenchyme pulmonaire et une protéine fluorescente rouge journaliste génétique qui étiquète mitochondries dans les OS des cellules dans le modèle de PuMA à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser sont également discutés.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’article technique suivant décrit certains aspects pratiques du modèle PuMA dans l’étude de colonisation de poumon dans les OS. Certaines étapes critiques du protocole où les chercheurs devraient prendre des précautions supplémentaires sont les suivantes :
un) canulation de la trachée. La trachée peut être facilement endommagée en disséquant les muscles environnants et le tissu conjonctif. En outre, l’aiguille du cathéter peut facilement être poussé à travers la traché…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Arnulfo Mendoza qui a dispensé une formation à la technique de PuMA. En outre, nous tenons à remercier les Drs Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) et Sam Aparicio (BC Cancer Agency) permettant l’utilisation de leurs microscopes au cours de cette étude. Cette recherche a été financée (en partie) par le programme de recherche intra-muros de la National Institutes of Health, centre de recherche sur le Cancer, service d’oncologie pédiatrique. M.M.L. a été soutenu par le National Institutes of Health intra-muros visitant Fellow Program (prix 15335) et est actuellement soutenue par une bourse de Parker de Joan dans la recherche de métastases. P.H.S. est pris en charge par la British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
