Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Summary

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Abstract

O ensaio de metástase pulmonar (PuMA) é um ex vivo explante de pulmão e o sistema de cultura de célula fechada que permite aos pesquisadores estudar a biologia da colonização de pulmão no osteossarcoma (OS) por microscopia de fluorescência. Este artigo fornece uma descrição detalhada do protocolo e discute exemplos de obtenção de dados de imagem em crescimento metastático usando widefield ou plataformas de microscopia de fluorescência confocal. A flexibilidade do modelo PuMA permite que os pesquisadores a estudar não só o crescimento de células do sistema operacional no microambiente do pulmão, mas também para avaliar os efeitos da terapêutica antimetastático ao longo do tempo. Microscopia confocal permite sem precedentes, de alta resolução de imagem de interações de celular so com o parênquima pulmonar. Além disso, quando o modelo de PuMA é combinado com corantes fluorescentes ou repórteres genética de proteína fluorescente, pesquisadores podem estudar o microambiente pulmonar, estruturas celulares e subcelulares, função do gene e atividade de promotor em células metastáticas do sistema operacional. O modelo da PuMA oferece uma nova ferramenta para investigadores de osteossarcoma descobrir a nova biologia metástase e avaliar a atividade da novela terapias anti metastáticas, direcionadas.

Introduction

Melhorado os resultados para pacientes pediátricos com metástase osteossarcoma (OS) continua a ser uma necessidade crítica de clínicas atendidas ¹. Isto ressalta a importância do desenvolvimento de novas terapias de alvo molecular. Chemotherapeutics convencional que a proliferação de células de tumor alvo não provaram para ser eficazes no tratamento da doença metastática e, assim, novas estratégias deve direcionar o próprio processo metastático ². O atual artigo aborda os aspectos práticos de um tipo relativamente novo de ex vivo modelo metástase do pulmão, o ensaio de metástase pulmonar (PuMA) desenvolvido por Mendoza e colegas³, que fornece uma ferramenta útil na descoberta de novos motoristas moleculares em progressão de metástases pulmonares em OS ^4,5. Antes de prosseguir, no entanto, seria prudente tocar brevemente sobre vários modelos atuais de metástase, e como o modelo da PuMA oferece diversas vantagens sobre os convencionais em vitro ensaios.

Modelos mais experimentais usados para estudar a metástase é composto por sistemas in vitro e in vivo que recapitular uma etapa específica ou várias etapas da cascata metastática. Estas etapas incluem: células de tumor 1) migrando longe o tumor primário, 2) intravasation em navios nas proximidades (sangue ou linfático) e trânsito na circulação, 3) prender no site secundário, 4) extravasamento e sobrevivência no local secundário, formação de 5) de micrometastases e 6) crescimento em metástases vascularizados (Figura 1). Modelos in vitro de metástase podem incluir a migração de 2-dimensional (2D) e 3-dimensional (3D) Matrigel invasão os ensaios que são revisados em detalham em outro lugar ⁶. Para os modelos na vivo , os dois sistemas modelo comumente usados incluem: 1) o modelo espontâneo de metástase é onde um células tumorais são orthotopically injetado em um tipo específico de tecido para formar um tumor local que derrama espontaneamente células metastáticas para locais distantes; 2) o modelo experimental de metástase é onde as células do tumor são injetadas para o vaso sanguíneo montante do órgão alvo. Por exemplo, uma injeção veia cauda dos resultados de células de tumor no pulmão do desenvolvimento metástases^5,7,8. Outros modelos experimentais metástase incluem injeção de células de tumor no baço ou veia mesentérica, que resulta no desenvolvimento de metástases hepáticas^9,10. Considerações práticas desses modelos na vivo são discutidas em detalhe por Welch ¹¹. Outro modelo na vivo costumava estudar metástase em sarcomas pediátricos é o modelo de implantação de tumor subcapsular renal rim que resulta na formação de tumor local e metástases espontânea para os pulmões ^12,13. Uma técnica mais tecnicamente exigente como tele-microscopia intravital pode visualizar diretamente, em tempo real, as interações entre as células do câncer metastático e a microvasculatura de um site metastático (ie. pulmão ou fígado) conforme descrito por MacDonald¹⁴ e Entenberg¹⁵, ou extravasamento de células de câncer na membrana corioalantoicas como descrito por Kim ¹⁶.

O modelo de PuMA é um ex vivo, explante de tecido do pulmão, sistema de cultura fechado onde o crescimento de células tumorais fluorescentes pode ser longitudinalmente observado através de microscopia de fluorescência durante um período de um mês (ver Figura 2A). Este modelo recapitula os estágios iniciais de colonização de pulmão (passos 3 a 5) na cascata metastática. Algumas vantagens principais do modelo PuMA sobre modelos convencionais em vitro são: 1) fornece uma oportunidade para medir o crescimento de células de câncer metastático em um microambiente 3D que mantém muitas características do microambiente do pulmão longitudinalmente em vivo ³; 2) puMA permite ao pesquisador avaliar se a derrubada de um tratamento de gene ou drogas de candidato tem atividade antimetastática no contexto de um microambiente pulmonar 3D; 3) o modelo de PuMA é flexível, com vários tipos de plataformas de microscopia fluorescência (Figura 2B) tais como a microscopia de fluorescência widefield ou microscopia confocal de varredura a laser, exemplos de cada um são mostrados na Figura 2 & D, respectivamente. Este artigo irá discutir como usar o modelo de PuMA para obter dados de imagem longitudinais sobre o crescimento metastático da proteína verde fluorescente melhorada (eGFP)-expressar, células humanas osteossarcoma de alto e baixo metastático (MNNG e HOS células, respectivamente) usando baixa ampliação widefield fluorescência. Exemplos de imagens, uma tintura fluorescente que rotula o parênquima pulmonar e uma proteína fluorescente vermelha repórter genética que rotula as mitocôndrias no so células no modelo PuMA usando microscopia confocal de varredura a laser também são discutidos.

Protocol

Todos os protocolos de animais, dos quais foram obtidos dados de imagem foram realizados com a aprovação do cuidado Animal e Comissão de uso do Instituto Nacional do câncer, os institutos nacionais de saúde. Todos os animais protocolos discutidos e retratado no artigo vídeo foram aprovados pelo Comitê de cuidados animais Universidade da Colúmbia Britânica. 1. preparação de células tumorais para injeção e materiais para o modelo PuMA Nota: A quantidade de…

Representative Results

Microscopia de fluorescência widefield Low-ampliação Para microscopia de fluorescência widefield de fatias de pulmão PuMA, imagens representativas e quantificação de dados é mostradas na Figura 2e Figura 4A e B. As propensões metastáticos para linhas de alta e baixa metastático célula são visualmente aparentes sobr…

Discussion

O seguinte artigo técnico descreve alguns aspectos práticos do modelo PuMA em estudar a colonização de pulmão no sistema operacional. Alguns passos críticos no protocolo onde pesquisadores devem tomar cuidado extra incluem o seguinte:

a) canulação da traqueia. A traqueia pode ser facilmente danificada enquanto dissecando o circundante do músculo e do tecido conjuntivo. Além disso, a agulha do cateter pode facilmente ser empurrada através da traqueia. Preste atenção a como o bisel …

Materials

Table 2
Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	highly metastatic OS cell line
HOS	ATCC	CRL-1543	poorly metastatic OS cell line
MG63.3	Amy LeBlanc Laboratory (NCI)	N/A	highly metastatic OS cell line
MG63	ATCC	CRL-1427	poorly metastatic OS cell line
10X M199 media	Thermofisher	11825015	Base media for A-media and B-media
Distilled Water (sterilized)	Thermofisher	15230-147	Component of A-media & B-media
7.5% sodium bicarbonate solution	Thermofisher	25080094	Component of A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Component of A-media & B-media
Retinol acetate-water soluable	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Component of A-media & B-media
Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution	Thermofisher	15140122	Component of A-media & B-media, complete media.
Bovine insulin solution (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Component of A-media & B-media
DMEM, high glucose	Thermofisher	11965092	Base media of Complete Media
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	Component of Complete Media
Fetal Bovine Serum	Thermofisher	16000044	Component of Complete Media
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Thermofisher	14190144	Used in cell culture.
Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red	Thermofisher	14175095	Used to resuspend cell pellet prior to injection
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermofisher	25200114	Used in cell culture.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Used to label lung parenchyma.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Inverted LSM confocal microscope
SCID mice	Charles River	N/A	NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Used as a support for lung tissue sections.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Used during insufflation of the lung.
1 ml syringe with 27 gauge needle	Fisherscientific	14-826-87	Used for tail vein injection.
10 ml syringe	BD	309604	Used for insufflation of the lung.
20 gauge catheter	Terumo	SR-OX2032CA	Used during insufflation of the lung.
Abbott IV extension set (30", Sterile)	Medisca	8342	Used during insufflation of the lung.
Alcohol swabs	BD	326895	For wiping tail vein before injection
Sterile surgical gloves	Fisherscientific	Varies with size	Asceptic handing of mouse lungs
30 cm ruler	Staples		Used for insufflation of the lung.
Support stand for ruler	Pipette.com	HS29022A	Used for insufflation of the lung.
35 mm glass-bottomed culture dish	Ibidi	81158	Used during imaging of lung slices
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014	Used to line the sterile work area in the biological hood.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	Used to tie off cannulated trachea.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 4
Surgical instruments for PuMA
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	For cutting lung sections
4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip	Roboz	RS-5132	For manipulating/holding lung sections.
4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip	Roboz	RS5135	For manipulating/holding lung sections.
Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width	Roboz	RS-8120	For general dissection.
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width	Roboz	RS-8100	For general dissection.
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade	Roboz	RS-5880	For general dissection.
Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length	Roboz	RS-5960	For general dissection.